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1、致病菌分子分型技术在食源性疾病暴发识别与溯源调查中的应用,自贡CDC 微生物检验所 刘祥,致病菌分子分型技术,2,基于实验室监测作用,1,2,5,基于实验室监测的定义,监测是征对公共卫生行动，系统而持续地收集、分析、解释、反馈公共卫生信息 基于实验室监测是征对公共卫生行动，系统而持续地收集、分析、解释、反馈实验室确诊病例信息,为什么要开展基于实验室的监测？,1、确定病原体，同时进行相应的病原体分型 2、监控每种病原体的变化趋势时间趋势（例如按照月、季度、年等）针对特定人群（例如腹泻患者、婴幼儿、孕妇等）,为什么要开展基于实验室的监测？,3、有助于有目的地制定病原体控制政策及措施4、提供确诊病例
2、信息以确定控制措施的有效性,基于实验室监测系统,公共卫生参比实验室（疾控中心）,卫生行政部门,临床实验室1,临床实验室2,临床实验室3,临床实验室4,1、公共卫生实验室进行分型发现病例聚集性 2、公共卫生实验室必须与流行病学家分享分型结果 3、流行病学通过调查聚集性病例发现暴发,致病菌表型分型与分子分型的方法对比,1.表型和分子分型各有优缺点；对于罕见血清型菌株，表型可发挥重要作用2.分子分型的方法各有优缺点，各有适用性，联合使用是主流3.实验方法和结果的质量保证是任何分析网络的最关键部分,为什么要做分子分型？,比较分型法 PFGE 核糖体分型 短期传播 局部区域暴发菌株克隆相关性 文库分型法
3、 MLST 核糖体分型 16S rRNA基因测序 种群进化 研究地域性传播和流行性变迁,并不矛盾，相互补充,综合手段,重点介绍以下几种分子分型方法,16S rRNA基因测序分型 PFGE（脉冲场凝胶电泳分型）MLST（多位点测序分型）,（一）16S rRNA基因测序,RNA,mRNAtRNArRNA,mRNA功能：把细胞核内DNA的碱基顺序，按照碱基互补的原则，抄录并转送至细胞质,在蛋白质合成中用以翻译成氨基酸的排列顺序。tRNA功能:在细胞蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的载体，并将各种氨基酸专呈给mRNA。rRNA：核蛋白体RNA，与核蛋白共同构成核蛋白体，即核糖体。原核生物的rRNA有5s
4、、16s、23s三种；真核生物有18s、5s、5.8s和28s。,核糖体RNA,蛋白质和RNA两部分组成原核生物核糖体（70S)小亚基(30S)大亚基(50S）小亚基(30S)16S rRNA(1542个核苷酸)（PCR扩增大小合适）蛋白质(21种）大亚基(50S）rRNA 5S，120个核苷酸 23S，2940个核苷酸 蛋白质(31种）,分子标志16S rRNA,存在于所有原核生物的细胞中，并执行相同的功能保守区域几乎与所有种属的核糖体靶位点结合异质性区域变异程度不能区分亲缘关系接近的细菌具有分子计时器的特点，分子序列变化缓慢，能跨越整个生命进化过程分子中含有进化速度不同的区域，可用于进化程
5、度不同的生物之间的系统发育研究进化树,16S rRNA序列分型,16S rRNA基因图特征,链球菌属16S rRNA序列分型,（二）脉冲场电泳技术（PFGE）,目前分子分型“金标准”敏感、特异、重复性高、分辨率高征对整条染色体分型,PFGE,细菌的染色体,稀有酶切位点,限制性内切酶消化,电泳,费用：100元/菌株,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,Electric Field 1,Electric Field 2,Switch Time,CHEF,动物、肉类和人的多重耐药Newport沙门菌分离株的PFGE图谱,已开展PFGE的菌种,非伤寒沙门菌伤寒与甲型副伤空肠
6、弯曲菌单增李斯特菌志贺菌大肠杆菌O157霍乱弧菌,脑膜炎奈瑟氏菌布鲁氏菌猪链球菌链球菌,食源性,非食源性,（三）多位点序列测定（Multi-Locus Sequence Typing，MLST）,分型的基础：细菌基因组内位于同一位点的看家基因的片段是否存在变异看家基因的测序不同的等位基因指派一定的数值，生成等位基因谱 每个等位基因谱认定为一个序列型（ST）进化树确定亲缘关系,MLST,可以用于暴发调查种群生物学分析，特别适合于分离株有足够时间进行分化的全球流行病学（Global epidemiology）研究,菌株之间的相互关系和系统发生关系研究,看家基因扩增,MLST分型方法实验流程,eBURST 软件分析菌株之间的亲缘关系,MLST 数据分析,START软件BURST软件,细菌性病原体的MLST 数据库,http:/,
