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1、实验一 细胞培养的基本技术一、实验目的1、了解细胞培养室的设置、设备和基本要求。2、掌握细胞培养用器械的清洗、消毒方法及无菌操作技术。二、实验材料1、实验设备：高压灭菌锅、电子分析天平、pH计、超净工作台、滤器、滤泵。2、实验器材：不同规格毛刷、烧杯、量筒、搅拌棒、瓷缸（陶瓷或玻璃）。三、实验步骤（一）器械的清洗1、玻璃器皿的清洗（植物细胞培养只需、操作即可）：清水浸泡：浸泡主要是软化器皿表面所附着的物质。刷洗：将浸泡后的玻璃器皿在洗涤剂中用毛刷反复刷洗，以除去器皿表面的杂质。烘干备用。浸酸：将经过刷洗和烘干后的玻璃器皿浸泡在由重铬酸钾、浓硫酸配置而成的清洁液中，利用强氧化作用清除瓶皿表面可能
2、残留的有机物。浸泡时间要在6小时以上，最好过夜（用于动物细胞培养）。冲洗：浸酸后的器皿从洗液中取出后，用自来水冲洗10遍以上。再用蒸馏水、三蒸水各清洗3遍以上，取出置于烤箱内（4050）烘干（用于动物细胞培养）。2、金属器械的清洗和消毒：金属器械不能在清洁液中浸泡，一般用洗涤剂洗刷干净后，再用自来水和蒸馏水反复冲洗干净，烘干。3、胶塞的清洗和消毒：细胞培养中使用的胶塞不能用清洁液浸泡。清洗过程中，要先在水中浸泡，然后2%NaOH溶液煮沸10分钟。自来水冲洗晾干后，再用1%的稀盐酸浸泡30分钟，最后再用自来水、蒸馏水、三蒸水进行常规清洗，烘干备用。注意使用后的胶塞应及时浸泡在清水中。4、塑料物品
3、的清洗：塑料物品用后立即用流水冲净或浸入清水中，防止干涸。一般不用刷洗以防划痕和损伤。清洗干净的器皿先在2%NaOH溶液浸泡过夜，自来水冲洗晾干后，再用1%的稀盐酸浸泡30分钟。最后再用自来水、蒸馏水、三蒸水进行常规清洗，烘干备用。注：清洁液的配制（盛装于瓷缸中，用于动物细胞培养时玻璃器皿的清洁）成分强酸溶液次强酸溶液弱酸溶液重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）6310002001202002001001001000（二）器械的消毒灭菌造成细胞培养失败的主要原因是发生污染，特别是微生物的污染，因此对细胞培养中所用的器械进行消毒灭菌是非常重要的。最常用的物理消毒方法有如下几种：1、紫外线消
4、毒：紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。目前，多用紫外灯直接照射培养室内空气、地面、工作台表面等进行消毒。2、高温干热灭菌：一般在烤箱中进行，主要用于消毒玻璃器皿。干热灭菌后的器皿干燥，易于存放。但是，干热传导慢，可有冷空气存留于烤箱内，需要较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的，因此需加温到160，保持90-120分钟。消毒后不可马上将烘箱门打开，以免冷空气进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外。3、压力蒸汽灭菌：一般使用高压蒸汽灭菌锅进行。为保证消毒的效果，待消毒的物品不应装得太满，以便消毒器内空气流通。在加热升压之前，打开排气阀门，以使加热后消毒器内的冷空气排出。冷空
5、气排完后，关闭排气阀门，开始升压，待达到所需压力后，开始计时，一般为100KPa、121下灭菌1520分钟。消毒完毕后，不要立刻打开盖子，应先等压力自行下降到一定程度后，打开排气阀，放气后，再打开消毒器的盖，将物品取出，放入烤箱内烘干。4、过滤除菌：是将液体或气体用具有微孔的薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的目的。目前，多数实验室采用微孔滤膜滤器除菌，滤膜孔径为0.220.45m。（三）培养材料的消毒灭菌采自自然界的实验材料，携带微生物及杂质，接种前须进行表面消毒灭菌，对内部已受微生物侵染的材料应予以淘汰。采来的实验材料先用流水冲洗1020min或更长时间，然后在一定浓
6、度药剂中浸泡处理（须在超净工作台上操作），进行表面消毒灭菌。所用的药剂种类、浓度、处理时间随植物种类和取用的器官部位的不同而异，常用消毒剂的灭菌效果见表1-1。消毒剂对植物组织是有毒的，应正确选择其浓度和处理时间，减少它对组织的伤害。经过灭菌的材料，需用无菌水清洗45次，沥去水分待用。表1-1 常用消毒剂消毒灭菌效果比较表消毒剂使用浓度（%）去除的难易消毒时间（min）效果次氯酸钙次氯酸钠漂白粉溴水过氧化氢升汞酒精抗生素硝酸银9102饱和浓度1210120.11707545（mg/L）1易易易易最易较难易中较难5305305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好较
7、好好（四）无菌操作室的消毒灭菌无菌材料进行接种或传代时，必须从各方面防止任何污染物进入容器，所以接种区的消毒至关重要。由于接种区的污染源主要是空气中的细菌和真菌孢子，因此长期停用后的无菌操作室应进行熏蒸消毒灭菌（常用每立方米含2ml甲醛和1g高锰酸钾的消毒液或6ml/m3乙二醇等加热熏蒸）。每次接种前都应进行地面卫生清洁，并用紫外灯照射20min，进行空气的消毒灭菌。对接种用的超净工作台，每次接种前用紫外灯照射20min，同时用7075%酒精擦洗，然后方可进行培养材料的接种。（五）无菌操作培养材料接种时的无菌操作过程除上述各项消毒灭菌操作外，还需完成以下无菌操作步骤，从而获得接种的无菌培养材料
8、。1、无菌操作前的准备工作：工作人员无菌操作前需穿好工作服、戴上工作帽和口罩，坐在超净工作台前，将各种操作所用金属器械浸泡在盛有95%（或70%）酒精溶液的广口瓶中，点燃洒精灯，在耐热器皿（如不锈钢小盘或搪瓷盘）中加入少量酒精，将蘸有酒精的金属器械及器械支架放入耐热器皿中灼烧，待冷凉后将器械置器械支架上备用，所有操作器械每次使用后都要灭菌；用70%75%的酒精擦拭新培养容器和继代培养容器表面，放置超净工作台上待用；再用同样浓度的酒精擦拭双手和前臂，完成无菌操作准备工作。2、无菌操作步骤：准备工作完成后，对来自于自然生长条件下的外植体，按前述培养材料的消毒灭菌方法灭菌后取出，放入已消毒灭菌的培养
9、皿中，然后置于超净工作台酒精灯火焰下方，用灭菌剪刀等器械进行适当分离、切割或其它处理后备用。在酒精灯火焰处将培养容器的瓶塞（盖）轻轻打开，瓶口在火焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，将镊子放在酒精瓶中蘸酒精，置于酒精灯火焰上灼烧后放回支架，然后迅速灼燎瓶塞（盖）数妙后塞回瓶口。对继代培养材料的无菌操作，需在灯焰处打开瓶塞（盖），继代培养材料为液体培养细胞时直接用灭菌吸管吸取培养细胞液放入新鲜培养基中；继代材料为固体培养细胞时，用灭菌镊子挑取适量材料置新鲜培养基上；继代材料为其它组织时，用灭菌剪刀或其它器械对培养材料进行适当切割后，用灭菌镊子将其置于新鲜培养基上（中），然后迅速灼燎瓶塞（
10、盖）数妙后塞回瓶口。3、污染源及其表现特征当培养材料、转接器皿、无菌操作环境等消毒灭菌不彻底时，培养材料则携带有微生物，当其被转接到营养丰富的培养基上时，微生物繁殖迅速，出现各种污染菌斑。微生物生长时分泌出对植物组织有毒的代谢废物，致使培养材料死亡或失去使用价值。在培养过程中，若培养材料附近出现黏液或混浊的水迹，并有发酵状泡沫，则是细菌性污染。在细菌性污染中，特别要注意一种呈乳白色的芽孢杆菌，它们出现在培养基表面，或呈滴形云雾状存在于培养基内，若出现应严格灭菌。而培养基表面出现的黄色、白色、黑色等不同颜色的霉菌，属真菌性污染。此外，需提及与微生物污染无关的酚类物质污染，因它也是培养材料常遇到的
11、问题，它是由于组织中的多酚氧化酶被激活，使细胞中的代谢发生变化，酚类物质被氧化后产生醌类，这类物质呈棕褐色，使培养材料褐变，甚至接种后使培养基变褐，严重影响培养物的生长发育。可以利用一些抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸等进行材料的预处理或预培养，或者在培养基中加入抗氧化剂或吸收酚类物质的化合物，如聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、活性碳等来减轻醌类物质的毒害。实验二 动物细胞培养基的配制一、实验目的1、掌握含血清细胞培养液的配制方法。2、掌握胰蛋白酶溶液的配制方法。二、实验材料1、实验设备：电子分析天平、pH计、超净工作台、滤器、滤泵。2、实验器材：烧杯、量筒、
12、搅拌棒、血清瓶（分装培养液用）、0.22m滤膜。三、细胞培养液DMEM的配制动物细胞培养使用的培养液一般由合成培养基和新生牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，即商品培养基或称干粉培养基。根据不同的细胞种类，可以选择不同的合成培养基。其中最常见最常使用的商品培养基为DMEM和RPMI-1640干粉培养基。本实验仅以DMEM为例，介绍其配制方法。1、按包装袋上的说明，将一袋DMEM粉剂用新鲜三（次）蒸馏水溶解。2、按包装袋上的说明，将一定量的NaHCO3加入DMEM溶液中。3、加入抗生素，使青霉素钠的终浓度达到100g/ml，（硫酸）链霉素的终浓度达到100U/ml。4、调培养液pH至7.07.
13、2（此时培养液为鲜红色，也称樱桃红色）。5、超净台内过滤除菌。6、加入经灭活处理的新生牛血清，其中浓度为10%20%（根据实际情况，血清可在细胞培养操作时加入）。7、分装，-20贮存备用（不加灭活血清的培养基可于4保存1个月）。四、胰蛋白酶溶液的配制1、D-Hanks溶液的配制：准确称取NaCl 8.0g、KCl 0.4g、Na2HPO412H2O 0.716g、KH2PO4 0.06g、NaHCO3 0.35 g，溶解于三（次）蒸馏水中，调pH至7.07.2，定容为1000ml。高压灭菌后，于超净台内加入过滤除菌的青霉素、（硫酸）链霉素，使其终浓度分别为100U/ml，100g/ml。4冰箱
14、保存待用。2、胰蛋白酶消化液的配制：用D-Hanks溶液将胰蛋白酶配成浓度为0.25%的工作液，过滤除菌后，-20贮存备用。实验三 动物细胞的传代培养及冻存一、实验目的1、 掌握细胞传代培养的原理及操作方法。2、掌握细胞冻存的方法。二、实验原理 传代培养是组织培养的常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中培养时，细胞不断生长增殖。对于贴壁生长的细胞，单层细胞互相汇合，整个瓶底逐渐被细胞覆盖。对于悬浮生长的细胞，细胞相互汇集成团。这时需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足，营养障碍而死亡。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中的过程称为传代（或称继代）。传代可
15、获得大量细胞供实验所需。 体外培养的细胞，随着传代次数的增加，其各种生物特性会渐渐发生变化。为此，需将培养的细胞及时冻存。直接冻存细胞会导致细胞内外环境形成冰晶，从而使细胞内部发生一系列变化，进而引起细胞死亡。因此，冻存细胞时常向培养液中加入适量的甘油或DMSO(二甲基亚砜)，从而使冰点下降，通过缓慢冻存，避免或减少冰晶的形成。三、实验材料1、实验设备：超净工作台、倒置相差显微镜、pH计、CO2培养箱、台式离心机、恒温摇床等。2、实验器材：吸量管、培养皿、离心管、冻存管、细胞记数板、细胞计数器、微量移液器等。3、实验试剂：D-Hanks溶液、含10%新生牛血清的DMEM培养液、0.25%胰蛋白
16、酶溶液、细胞冻存液。四、实验步骤（一）细胞传代1、贴壁生长的细胞（1）取80%汇合或刚汇合形成单层的细胞，吸弃旧培养液，用平衡盐溶液洗去残留的培养液。（2）加入少量的胰蛋白酶液，37放置3-5分钟，倒置相差显微镜下观察，细胞变圆后，用灭菌的吸量管进行吹打，使细胞脱离培养瓶壁。（3）终止消化，吸弃消化液，加入含有血清的培养液。（4）用吸管吸取培养瓶内的培养液溶液，反复吹打培养瓶底壁，使细胞分散。（5）吹打获得的细胞悬液经1,000 rpm离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀用培养液重新悬浮后记数。（6）按照一定的细胞密度将部分细胞接种于新培养瓶中，补给一定量的新鲜培养液，继续培养。2、悬浮生长的细胞（
17、1）将细胞悬液转入离心管内，1,000rpm,离心5分钟。（2）弃上清，加入新鲜的培养液到离心管中，反复吹打，使细胞分散。（3）细胞记数。（4）按照一定的细胞密度将部分细胞接种于新培养瓶中，补给一定量的新鲜培养液，继续培养。（二）细胞冻存：1、配置冻存液：即含10%DMSO及20%小牛血清的DMEM细胞培养液。2、依照传代的方法把消化好的细胞收集于离心管中，计数后离心。3、去除离心后的上清，加入冻存液，使细胞密度达到5106 - 1107/ml。4、吹打细胞制成悬液，分装入冻存管中。5、细胞分级冷冻要点缓慢逐步降温：4冰箱1小时；-20冰箱1小时；-80冰箱24-48h；液氮罐中长期保存。实验
18、四 化疗药物对肿瘤细胞杀伤的敏感实验一、实验目的掌握肿瘤细胞药敏实验设计与操作及结果分析。二、实验原理肿瘤细胞针对不同的化疗药物的杀伤，有不同的敏感性。筛选出针对肿瘤高敏感而毒性小的化疗药物，对于指导肿瘤治疗的临床用药有重要意义。其实验原理为：将一定细胞数的肿瘤细胞接种于96孔培养板中，加入不同种类、不同浓度的化疗药物，作用24-48小时后，利用MTT法检测细胞存活情况，来判定肿瘤细胞对各种化疗药物的敏感性，从而筛选出针对这种肿瘤有效的化疗药物。三、实验材料1、实验设备：离心机、CO2培养箱、酶标仪2、实验器材：吸管、离心管、微量吸液管、微量移液器、96孔培养板3、实验试剂：MTT、含10%
19、FCS的培养基、PBS、DMSO（二甲基亚砜）、胰酶4、化疗药物：顺铂（DDP）、足叶乙甙（VP-16）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、长春新碱（VCR）5、细胞株：HeLa（人宫颈癌细胞株）、HeP-2（人喉癌细胞株）、HCT/8（人结肠癌细胞株）、U251（人胶质瘤细胞株）四、实验步骤（一）化疗药物浓度配置不同剂量组药物实验终浓度(g/ml)分组血浆峰值浓度倍数DDP5-FuVP-16VCR110120200060082112200600.830.11.22060.0840.010.1220.60.008使用的化疗药物浓度按照血浆峰值浓度(g/ml)= 50 （临床每日用量（mg/ Kg）/5
20、000）2 103）计算，以10倍、1 倍、0.1 倍、0.01 倍实验，四种药物具体用量见上表：（二）步骤1、细胞培养及加药（1）将HeLa、HeP-2、HCT/8、U251消化，计数、以每孔1105细胞数接种到96孔板，每孔培养基液体为200l，每一张96孔板接种两种细胞。（2）将4种化疗药物以四种浓度，10l加入各个孔中，做5平行孔，剩余孔做对照组。（3）将96孔板放入CO2培养箱，培养48小时。2、药物杀伤效率的测定（1）向培养48小时后的细胞孔内加入10l MTT ，37作用3小时。（2）吸弃孔内液体，用PBS洗一次，加入200l DMSO，室温作用5分钟，可以轻微震荡，使蓝色结晶全
21、部溶解。（3）在酶标仪492nm处测定吸光度值。（4）计算细胞的杀伤敏感率：敏感率（%）=（对照组OD492药物组OD492）/ 对照组OD492100%，超过50%为高度敏感。思考题在设计药物对细胞的杀伤实验中，应注意哪几点？实验五 细胞融合实验一、实验目的1、 掌握杂交瘤技术的原理和细胞融合的基本方法。2、 了解筛选杂交瘤细胞，克隆化培养，单克隆抗体的制备与鉴定。二、实验原理杂交瘤技术主要是由免疫动物，细胞融合，筛选杂交瘤细胞，克隆化培养，单克隆抗体的制备与鉴定等一系列实验组成的实验系统，其核心是细胞融合。免疫动物及细胞融合：为了获得单克隆抗体，首先需要用特定的抗原免疫纯系动物已获得分泌预
22、定抗体的B淋巴细胞，将分泌预定抗体的B淋巴细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合成为杂交瘤细胞，这种杂交瘤细胞获得了双亲本细胞的特性，既有分泌抗体的能力，又有无限繁殖的能力。通常采用聚乙二醇促融。筛选杂交瘤细胞，在细胞融合的过程，除了形成杂交瘤细胞外，还可能存在B淋巴细胞和B淋巴细胞的融合，骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合及未融合的亲代细胞，脾脏细胞在体外培养10天左右会自行衰亡，对杂交瘤细胞的生长无影响，而未融合的骨髓瘤细胞或其自身融合物，由于生长快，会抑制杂交瘤细胞的生长。因此必须进行选择培养，通常应用HAT培养基筛选杂交瘤细胞。HAT培养基是在一般的培养基内添加了叶酸拮抗物氨基喋呤，用以阻断
23、嘌呤和嘧啶的内源性生物合成途径，并提供了核苷酸的前体胸腺嘧啶核苷、次黄嘌呤等，供细胞外源性生物合成用。细胞DNA合成有主要通路和旁路两条途径，当细胞DNA合成主要通路被氨基喋呤阻断时，细胞可利用旁路进行DNA的合成。在杂交瘤技术中应用的骨髓瘤细胞是经过用嘌呤类似物8-氮鸟嘌呤或6-巯基鸟嘌呤筛选而得到的遗传基因缺陷型细胞系，它们缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶或胸腺嘧啶核苷激酶，无法利用补充的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷旁路合成DNA，从而导致骨髓瘤细胞死亡，杂交瘤细胞在染色体杂交后，经旁路合成DNA， 使杂交瘤细胞得以繁殖生存。克隆化培养：生长繁殖的杂交瘤细胞并非每个都能分泌预定的抗体。因此，必
24、须利用免疫荧光检测技术，免疫酶测定技术等手段，筛选出稳定分泌预定抗体的杂交瘤细胞。为了保证分泌抗体的单一性，还必须通过有限稀释法或软琼脂克隆培养法进行多克隆化培养，这样就可以用来大量制备单克隆抗体。单克隆抗体的大量制备与鉴定：制备单克隆抗体的方法有两种，一是动物体内诱生法，即将杂交瘤细胞接种于同系小鼠或裸鼠腹腔内，经一定的时间，动物腹腔内产生含单克隆抗体的腹水；另一类是体外培养法，如悬浮培养系统，即采用转瓶或发酵罐式的生物反应器以及中空纤维细胞和微囊化细胞培养系统。三、实验材料1、实验动物：7-12周龄BALB/C小鼠。2、实验细胞：骨髓瘤细胞MOPC-21。3、手术器械：大钩镊、眼科剪。4、
25、实验器皿：玻璃平皿、吸量管、50 ml离心管、孔径45m尼龙纱网、96孔培养板。5、实验试剂：碘棉、75%乙醇、HAT选择培养基、PEG1000溶液、无血清RPMI-1640培养基。 RPMI-1640培养液的配制：按包装袋上的说明，用新鲜三次蒸馏水配制。内含10%新生牛血清，2mmol/L左旋谷氨酰胺、100g/ml 青霉素钠、100U/ml（硫酸）链霉素，调pH=7.07.2，过滤除菌，分装，-20贮存备用。HAT培养液的配制：在含10%小牛血清的RPMI1640中，加次黄嘌呤136g/ml，氨基喋呤0.19g/ml，胸腺嘧啶3.88g/ml，冷冻避光保存（氨基喋呤对光敏感）。PEG100
26、0溶液（50%）的配制：取25ml PEG1000 溶液加入25ml无小牛血清的RPMI1640溶液，常温保存。6实验设备：超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、台式离心机、电子分析天平、酸度计等。四、实验步骤1、骨髓瘤细胞的培养：骨髓瘤细胞以悬浮或半贴壁形式生长，用吸管吹打使细胞分散，传代培养，通常是细胞处于对数生长期。用于融合实验的骨髓瘤细胞还必须对HAT培养液敏感。在融合实验前两周，细胞要培养在筛选建株时应用的碱基类似物致死剂8-鸟嘌呤培养基中。融合前一天传代一次，接种浓度可为41055105/ml并换为常规培养液。2、制备饲养层细胞（小鼠腹腔渗出细胞）：为了使融合后的杂交瘤细胞获得
27、最佳的生长条件以及增加杂交瘤的产量，常需制备饲养层。BALB/C小鼠脱颈处死后，75酒精浸泡5min，无菌暴露腹腔，腹腔内注射10ml RPMI-1640培养液，吸出腹腔渗出细胞调整浓度到1105/ml，接种于96孔板，每孔100l。3、免疫脾细胞制备：（1）免疫动物：根据骨髓瘤细胞株的来源选择脾细胞的供体。目前应用的最普遍的是BALB/C小鼠，免疫动物所用的抗原剂量取决于免疫原性。细菌、病毒颗粒性抗原一般具有较强的免疫原性，用这类抗原免疫动物可不用佐剂，而可溶性抗原常需加佐剂，在小鼠颈背部皮下多点注射或腹腔注射，隔24周后，取同量的抗原加不完全佐剂追加免疫一次，再间隔4周，取同量的抗原不加佐
28、剂经静脉或腹腔追加免疫。（2）制备免疫脾细胞悬液：BALB/C小鼠脱颈处死后，75酒精浸泡5min，无菌暴露腹腔取脾，放入无血清RPMI-1640培养基进行研磨，尼龙纱网过滤，吸取脾细胞悬液进行离心（1500rpm，5min），弃上清，加少量培养液重悬细胞并计数，一般一个脾脏平均可得1108个脾细胞。4、细胞融合：（1）融合前一天将PEG1000放入CO2培养箱中调整pH至7.2-7.4。（2）将PEG1000和培养液置37水箱中温热。（3）将骨髓瘤细胞和免疫脾细胞以1：5的比例（2107个骨髓瘤细胞和1108个脾细胞混合），用小玻璃棒轻轻地混合无血清培养液中的细胞，避免用吸管强烈地吹吸以免损
29、伤细胞，离心1500rpm，5min。（4）弃掉所用的上清（PEG的浓度是严格的，若遗留上清液将影响PEG浓度），不要旋动或敲打试管，保持细胞团完整。（5）将试管放在恒温干浴中，保持37温热，用1ml吸管慢慢地将37预温的50%PEG1000溶液0.8ml加至密集的细胞团中，用吸管尖端慢慢搅动，使PEG与细胞混合，但不要吹吸。（6）试管仍放在干浴中，用吸管尖端继续缓缓搅动1分钟。（7）在1分钟内加完1ml预温的培养液，试管仍放在干浴中以保持温度，重复一次此操作。（8）于2分钟内加入10ml37预温的培养液。（9）1500r/min离心10分钟。（10）去除上清液，重新将细胞悬浮于培养液中，使最
30、后浓度为1106细胞/0.12ml （相当于5ml吸管的2滴）。（11）用无菌的5ml吸管，将细胞悬液加于已在前一天接种了饲养细胞（每孔含1104饲养细胞/0.1ml)的96孔培养板中，每孔2滴。 思考题制备杂交瘤细胞的关键是什么？实验六 植物细胞培养基的种类及配制一、实验目的1、了解植物细胞培养基的种类及营养要求。2、掌握MS培养基的配制方法。二、实验材料1、实验设备：高压灭菌锅、电子分析天平、pH计、超净工作台。2、实验器材：电磁炉、烧杯、量筒、搅拌棒、吸量管、移样枪。三、植物细胞培养基的种类在100多年的植物组织、器官和细胞离体培养研究中，研制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞
31、生长发育的培养基配方，但多数培养基是在几种普遍应用的培养基上演变而来的，其中应用最为广泛的仍为MS培养基。植物组织培养基早期的建立，如White提出的根培养基和Gautheret提出的愈伤组织培养基，都是由先前的用于整体植物栽培的营养液发展而来的。以后所有的各种培养基又都是在White培养基和Gautheret培养基的基础上形成的。各种培养基在无机营养组成上的差异主要是盐和离子数量上的不同。常用培养基中根据无机盐的含量可以分为4类，分述于下：1、高无机盐含量培养基：高无机盐含量培养基中，钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，养分数量及比例较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体
32、的培养。主要有MS培养基和ER培养基。2、较高硝酸钾含量培养基：较高硝酸钾含量培养基适合于木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主要有B5培养基和N6培养基。3、中等无机盐含量培养基：中等无机盐含量培养基中，大量元素约为MS培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较MS的高，适合于花药培养。主要有Nitsch培养基和NT培养基。4、低无机盐含量培养基：低无机盐量培养基中，大量元素含量大幅降低而且种类减少，多数用于生根培养基。主要有White培养基和Heller培养基。各种植物培养基的营养组成及配方如下表：表6-1 植物培养基种类及成分培养基成分培养基（mg/L）MS（1962）ER
33、（1965）B5（1968）N6（1975）Nitsch1963NT（1971）White（1963）Heller（1953）NH4NO3KNO3CaCl22H2OCaCl2MgSO47H2O1 6501 900 440 3701 2001 900 440 3702 527.50 1502502 830 166 185 720 950 166 185 825 950 220 1 233 80 750 75 250KH2PO4（NH4）2SO4Ca（NO3）24H2ONaNO3Na2SO4 170340 134 400 463 68 680 300 200600NaH2PO4H2OKClKIH3
34、BO3MnSO44H2O 0.83 6.20 22.30 0.63 2.23 150 0.75 3.00 0.80 1.60 4.40 10.00 25.00 0.83 6.20 22.30 19.00 65.00 0.75 1.50 5.00 125 750 0.01 1.00 0.10MnSO4H2OZnSO47H2OZnSO44H2OZnNa2EDTANa2MoO42H2O 8.60 0.25 15.00 0.025 10.00 2.00 0.25 3.80 10.00 0.25 8.60 0.25 3.00 1.00MoO3CuSO45H2OCoCl26H2OCoSO47H2OAlCl
35、3 0.025 0.0250.0025 0.00250.025 0.025 0.025 0.025 0.03 0.001 0 .01 0.030.03NiCl26H2OFeCl36H2OFe2（SO4）3FeSO47H2ONa2EDTA2H2O 27.80 37.3027.80 37.3027.80 37.3027.80 37.3027.80 37.3027.80 37.30 2.50 0.03 1.00肌醇烟酸盐酸吡哆醇盐酸硫胺素甘氨酸100 0.50 0.50 0.10 2.000.50 0.50 0.50 2.00 100 1.00 1.00 10.00 0.50 0.50 1.00 2
36、.00 1005.00 0.50 0.50 2.00 100 1.00 0.05 0.01 0.01 3.00叶酸生物素蔗糖D-甘露醇30 00040 00020 00050 0000.50 0.0520 000 10 000127 00020 000四、MS培养基的配制植物细胞培养基种类很多，如MS、ER、B5、N6、NT和White等。本实验以MS完全培养基为例，介绍植物细胞培养基的配制方法。（一）MS培养基母液的配制母液的配制是按药品的种类和性质分别配制，单独保存或几种混合保存。配制好的母液种类一般有大量元素、微量元素、钙盐、铁盐、有机营养和单独保存的各种生长调节类物质。大量元素一般配制
37、成10倍浓度的母液，微量元素和有机物常配制成100倍浓度的母液。表6-2 MS培养基配方母 液成 分规定量（mg/L）扩大倍数称取量（mg）母液体积（mL）配1L培养基吸取量（mL）编号种类1大量元素KNO31 9001019 0001000100NH4NO31 65016 500MgSO47H2O3703 700KH2PO41701 7002钙盐CaCl22H2O440104 40010001003微量元素MnSO44H2O22.31002 230100010ZnSO47H2O8.60860H3BO36.20620KI0.8383Na2Mo42H2O0.2525CuSO45H2O0.0252
38、.5CoCl26H2O0.0252.54铁盐Na2EDTA37.301003 730100010FeSO44H2O27.802 7805有机物质甘氨酸2.005010050010盐酸硫胺素0.105盐酸吡哆醇0.5025烟酸0.5025肌醇1005 000表6-2提供了MS培养基母液的配方。将各种化合物按指定扩大倍数准确称量、分别溶解后，按先后次序加入蒸馏水中，最后用蒸馏水定容。注意：在混合定容时，一定要掌握药剂的先后次序或稀释度，以免发生沉淀。钙盐和铁盐由于与其它母液混合容易发生沉淀反应，因此需单独配制。铁盐为螯合状态时，有利于植物在适宜的pH下吸收和利用，因此需与螯合剂Na2EDTA混合配
39、制。生长调节类物质一般分别配制成0.21.0mg/L的母液，用时按量吸取。某些生长调节剂不溶于水，需用不同溶剂进行溶解，如NAA、2,4-D、IAA、IBA、GA3是醇溶性的，配制时先用少量95%酒精溶解，然后再用蒸馏水定溶；KT、6-BA、2ip、ZT先溶于少量1mol/L盐酸中，然后再用蒸馏水定容；叶酸先用少量稀氨水溶解后再定容。配制好的各种母液倒入棕色瓶中，贴好标签，保存于4冰箱中备用。注意：母液保存于冰箱中的时间不宜过长，一般为12个月，当母液出现沉淀或霉菌团时，则不能再使用。（二）MS完全培养基的配制以配制1 000mL MS完全培养基为例，配制全过程如下：1、 在洁净的不锈钢（或搪
40、瓷）容器中加入1/2终体积（500mL）的蒸馏水；2、 按表2内容规定的量，精确吸取各种母液，依次加入到盛有1/2终体积蒸馏水的不锈钢（或搪瓷）容器中，记录此时的总体积。注意：母液不能混合后加入，也不能同时加入，必须依次缓慢加入，且要一边加入一边搅拌，以免造成电解质局部浓度过高而发生沉淀反应；3、 根据培养目的及要求，加入所需量的各种生长调节物质，记录此时的总体积（如用于长春花叶愈伤组织的诱导：加入2,4-D 1.0mg/L、6-BA 0.5mg/L、 NAA 1.0mg/L、KT 0.2mg/L）；4、 加入30g蔗糖，5g聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP，抗
41、氧化剂，防止或减轻植物组织褐化，也可用一定量的维生素C、活性碳代替，或不加，视情况而定），充分混匀后，补充蒸馏水至终体积1 000mL，然后用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节培养基至pH5.8；5、 精确称取15g琼脂加入其中，在电磁炉上煮沸溶解琼脂。此过程需加以搅拌，防止琼脂在锅底烧焦或沸腾溢出；6、 琼脂溶解后，及时将培养基分装于150mL三角瓶中，约50mL/瓶，包膜密封，并于100KPa、121下灭菌1520分钟。冷却备用。注意：培养基的pH直接影响培养物对离子的吸收，过酸或过碱不仅影响到培养材料的生长，而且还影响到琼脂的凝固，pH低于5.5时，琼脂凝固程度不好，pH高于6.
42、0时，琼脂过度凝固，培养基变硬，不利于培养材料对营养物质的吸收及对代谢废物的排放，从而影响培养材料的生长。培养基的pH可用酸度计测试，并用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调整至适宜范围（1mol/L盐酸配制方法：取12mol/L HCl 84mL，加入蒸馏水定容至1 000mL；1mol/L氢氧化钠配制方法：称40g NaOH，溶解后加入蒸馏水，定容至1 000 mL）。培养的植物材料其生长最适pH范围为5.66.0，培养基经高压高温灭菌后，由于某些成分的降解或氧化，酸度会增加，pH一般可降低0.2，因此配制植物培养基时，通常调整pH至5.8。对于某些不能高压高温灭菌的试剂或药品，必须过
43、滤除菌，待培养基灭菌后未凝固之前（4560）加入，并轻摇使混匀。这时，每个培养容器的装入量和过滤除菌后的物质都要事先计算好，定量加入其中。植物培养基的配制程序可用流程图表示如下： 水药品 混匀 pH调整 琼脂 加热溶解 糖 玻璃器皿 水洗 干燥 分装 密封 接种 冷却 高温蒸汽灭菌 实验七 长春花叶片愈伤组织的诱导一、实验目的通过对长春花叶片愈伤组织的诱导，分析生长素和细胞分裂素对长春花叶片离体培养的作用，熟练掌握植物组织离体培养培的基本操作技术，了解植物组织在离体培养条件下脱分化的条件及特点。二、实验原理根据植物细胞全能性理论，利用MS培养基，加入一定浓度的生长素和细胞分裂素对长春花叶片组织进行培养，在光照
