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1、 Agilent 1200 LC（中文版 B01.01）现场培训教材 安捷伦科技有限公司 生命科学与化学分析仪器部一、 培训目的： 基本了解1200LC硬件操作。 掌握化学工作站的开机，关机，参数设定,学会数据采集,数据分析的基本操作。二、 培训准备：1、仪器设备： Agilent 1200LC G1310A :(单元泵)；G1312A(二元泵)；G1311A(四元泵)。 G1313A（标准型自动进样器）。 G1316A（柱温箱）。 G1314A（VWD检测器）。 G1362A（示差检测器）。 色谱柱: Eclipse XDB-C18 150 x 4.6 mm, 5um column P/N
2、993967-9022、溶剂准备： 色谱级纯或优级纯乙腈或甲醇。 二次蒸馏水基本操作步骤: (一)、开机： 1、打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序。 2、打开 1200 LC 各模块电源。 3、待各模块自检完成后，双击“Instrument 1 Online”图标，化学工作站自动与1200LC 通讯，进入的工作站画面如下所示。 4、从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面, 点击“视图”菜单中的“显示顶部工具栏”，“ 显示状态工具栏”，“系统视图”,“样品视图”，使其命令前有“”标志，来调用所需的界面。 5、把流动相放入溶剂瓶中。 6、打
3、开冲洗阀。 7、点击“泵”图标，点击“设置泵”选项，进入泵编辑画面。 8 、设流速：5ml/min，点击“确定”。 9、点击“泵” 图标，点击“控制”选项，选中“启动”，点击“确定” ，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。 10、点击“泵” 图标，点击“控制”选项，选中“关闭”，点击“确定”关泵， 关闭冲洗阀。 11、点击“泵”图标，点击“设置泵选项”，设流速：1.0ml/min。 12、点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以单元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。 也可输入停泵的体积，点击“确定”。（二）数据采集方法编辑： 1
4、、开始编辑完整方法： 从“方法”菜单中选择“编辑完整方法” 项，如下图所示选中除“数据分析 ”外的三项，点击“确定”，进入下一画面。2、方法信息： 在“方法注释”中加入方法的信息（如：测试方法）。 点击 “确定”， 进入下一画面。3、泵参数设定：（以四元泵为例） 在“流速”处输入流量,如1ml/min，在“溶剂 B”处输入80.0,(A=100-B-C-D) ,也可“插入 ”一行“时间表” ,编辑梯度。在“压力限”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 点击“确定”，进入下一画面。4、自动进样器参数设定:（以标准G1313为例） 选择合适的进样方式, 如图所示，进样体积 5.0ul ,洗瓶位置为
5、6号。“标准进样”-只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“洗针进样”-可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“使用进样器程序”-可以点击“编辑” 按钮进行进样程序编辑。 点击进“确定”，进入下一画面。5、柱温箱参数设定: 在“温度”下面的空白方框内输入所需温度,如：40度。并选中它,点击“更多” 键,如图所示,选中“与左侧相同”，使柱温箱的温度左右一致。 点击“确定”，进入下一画面。 6、VWD检测器参数设定: 在“波长”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm, 在“峰宽 (响应时间)”下方点击下拉式箭头,选择合适的响应时间, 如0.1min (2s)。
6、 在“时间表” 中可以“插入”一行，输入随时间切换的波长，如1min ，波长=300nm。点击“确定”，进入下一画面。7、 RID检测器参数设定: 色谱条件: 进样体积: 20ul 。 光学单元温度: “关闭” 。 极性: “正极性” 。 峰宽(响应时间) : 4s 。 如图所示: “光学部件温度”-若环境温度控制在2,设定为“关闭”, 若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度5度,以防样品在池中沉淀。“峰宽 (响应时间)”-大多数分析设为“ 4s” ，只有在高速分析下设为更短。“分析后自动循环”-在不进行分析时可以让流动相循环，节省流动相，检测器连续运行，可随时投入使用。 * 点击
7、RID图标，选择RID Control ：Heater 设为On，若要循环流动相，必须将“Recycling Valve”设为ON。手动purge 参比池，将其设为On，并输入Purge 时间。 8、 在“ 运行时选项表 ”中选中“ 数据采集”，点击“确定”。9、 点击“方法”菜单，选中“方法另存为”，输入一方法名，如“测试”，点击“确定”。10、 从菜单 “视图”中选中“在线信号”,选中“信号窗口1”,然后点击“改变” 钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击“确定”。(如同时检测二个信号,则重复10,选中“信号窗口2”。单击“改变”键，即可弹出右侧的“编辑信号图谱”窗口，进而选择所需的谱图
8、信号。11、 从“运行控制”菜单中选择“样品信息”选项，如下图所示，输入操作者名称，如“安装工程师”；在“数据文件 ”中选择“手动”或“前缀/计数器”。区别: 手动-每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖掉。 Pr在前缀/计数器-“前缀”框中输入前缀，在“计数器”框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd数据0001，vwd数据0002。12、 点击“确定” ,从“仪器” 菜单选择“系统开启”。13、 等仪器准备好，基线平稳，从“运行控制”菜单中选择“运行方法”，进样。(若无自动进样器，则基线平稳后，进样并搬动手动进样阀，启动运行。)（DAD, VWD色谱图如下所示：）
9、（三）、数据分析方法编辑:1、 从“视图”菜单中，点击“数据分析”进入数据分析画面。2、 从“文件”菜单选择“调用信号”，选中您的数据文件名，如下图所示。点击“ 确定”，则数据被调出。3、 做谱图优化： 从“图形”菜单中选择“信号选项”，如下图所示。从“范围” 中选择“满量程” 或“自动量程” 及合适的时间范围或选择“自定义量程” 调整。反复进行，直到图的比例合适为止。点击“ 确定”。4、积分: 从“积分”菜单中选择“积分事件”选项，如下图所示。选择合适的“斜率灵敏度”，“峰宽”，“最小峰面积”，“最小峰高”。 从“积分”菜单中选择“积分”选项， 则数据被积分。 如积分结果不理想，则修改相应的
10、积分参数，直到满意为止。 点击左边“”图标，将积分参数存入方法。5、打印报告: 从“报告”菜单中选择“设定报告”选项，进入如下图所示画面。 点击“定量结果”框中“计算”右侧的黑三角，选中“面积百分比”，其它选项不变。 点击“ 确定”。 从“报告”菜单中选择“打印报告”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则点击“报告” 底部的“打印”钮。(四)、关机: 关机前，先关灯，用相应的溶剂充分冲洗系统。 退出化学工作站，依提示关泵，及其它窗口，关闭计算机。 关闭Agilent 1200各模块电源开关。(五)、Agilent 1200 LC维护保养：1、 色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶
11、剂，两端封死（如乙腈/甲醇适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）。2、 手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口。3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。4、带seal-wash的 1200，要配制90%水+10%异丙醇，开启seal-wash清洗泵，溶剂不能干涸。5、注意事项见说明书，或由现场工程师介绍。*注意：1、 本教材仅适用于现场工程师培训讲解参考之用，内容为工作站现场培训的一般要求，请根据用户的仪器配置及现场用户的需求进行相应的培训内容增删。2、 安捷伦公司对本教材可能存在的错误及其后果不承担任何法律责任，我们适时推出新版本的培训教材，恕不另行通知。维
12、护知识问答1、 为什么溶剂和样品要过滤? 溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。2、 为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？ HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效
13、的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项.清洗液配制: 90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力，不能干涸。3、 为什么Agilent 1200LC的流动相管路非常细? 在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小45个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低 。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，
14、Agilent 1200LC 使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。毛细管线分类：0.17mm内径 -绿色 ;0.12mm内径-红色。 PEEK 管线：内径 -0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。 毛细管线优点: 柔韧性好. *Agilent 公司同时备有1/16in 的粗外径毛细管线,适用于不同习惯的用户 ,优点是刚性好,但柔韧性差一些。 4、 流动相使用前为什么要脱气？ 流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还
15、会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。常用的脱气方法比较： 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10- 15min，此法效果最差。在线真空脱气法：Agilent1200LC真空脱机利用膜渗透技术， 在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？ 溶剂的质量或污染以及
16、藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=47）。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。A：请严格执行溶剂过滤。B：请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液C：如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001-0.001M的叠氮化钠. D:在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。E：避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。6、 Agilent 1200LC泵如何维护？Agilent 1200LC泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的流动相，及时合理的维护非常重要。A：流动相使用前请必须脱气、过滤。B：使用缓冲
17、盐时，要加在线Seal-wash选项。C：关机前，用相应的溶剂充分冲洗系统。 D：及时更换Purge Valve内的过滤芯。（当打开Purge Valve时，压力高于10bar，表明过滤芯已堵）。 E：使用合适的密封圈。7、 如何选择合适的泵头活塞密封圈？ 泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用，但使用正相溶剂（如正己烷），不适合使用标准活塞密封圈，特别是长时间使用时，需更换另一种不同的密封圈，我们建议使用聚四氟乙烯密封圈。（p/n0905-1420 2/pk）*注意：聚四氟乙烯密封圈的压力范围为：0200bar；建议在泵的压力限制中，将最大压力设为200bar。8、 使用梯度比例发时要注意那
18、些事项？ 当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，通常，阀A接水相/盐溶液，D接有机溶剂，此法连接可有效使盐回落到盐溶液中，并被溶解。若颠倒过来，盐可能落在有机溶剂中，出现问题。强烈建议：当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时，推荐将缓冲盐通道接在A通道上，有机溶剂通道直接接在A通道的上方D通道上；定期用水冲洗所有的通道，以除去阀口上可能出现的盐沉淀。9、 更换色谱柱时要注意什么事项?在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小45个数量级，液体流动相的流速
19、也比气相慢1-2个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低 。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，仪器的流动相管路连接非常重要,一般Agilent 1200LC 在第一次安装时,均有受过专业培训的安装工程师负责安装,各种接头会处理的非常完美。客户只需在更换色谱柱时注意接头处理就可以了，一般柱子入口接头为不锈钢卡套接头，柱子出口为不锈钢卡套接头或PEEK管线手拧街头，当完成第一次安张后，不锈钢卡套已固定死，当接不同的柱子时，要注意柱子接头处的形状和长度，否则会产生一个非常大的死体积。
