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1、青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定 福建农林大学硕士学位论文青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定姓名:陈虹申请学位级别:硕士专业:农产品加工与贮藏指导教师:郑宝东20070401摘要青梅.,属蔷薇科李属,具有丰富的营养价值和医疗保健作用,是我国特色果品资源。本文研究了青梅汁对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种细菌的抑制作用;探讨了青梅汁的抗氧化性能;按保健食品功能学评价程序研究了青梅汁对清洁级小鼠记忆再现障碍的改善作用;采用气相色谱和质谱联用仪定性和定量分析青梅汁的功效成分及其含量,研究成果为开发利用青梅特色资源提供理论依据。.研究了青梅汁对细菌的抑制作用。结果表明:青梅汁对金黄色葡
2、萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种菌种均有显着的抑制作用,但青梅汁的抑菌效力与其酸度无关,可能是由其内在小分子起作用。青梅汁经高温处理后,仍具有较强的抑菌效力。在细菌适宜生长的值范围内,改变值对青梅汁抑菌效力影响不大。青梅汁对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为%,对大肠杆菌的最低抑菌浓度为%,对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为%。.利用反应研究青梅汁清除?的作用;利用邻苯三酚自氧化法研究青梅汁清除?的作用。同时以茶多酚做阳性对照,结果表明:青梅汁能有效地清除羟自由基和超氧阴离子自由基,且清除能力随浓度增大而增大,提示青梅可能是抗氧化保健食品的优质原料。.按保健食品功能学评价程序,采用水迷宫方法研究青梅
3、汁对清洁级小鼠记忆再现障碍的改善作用。结果表明:%浓度青梅汁与模型组差别有统计学意义,与阳性对照组脑复康组差别无统计学意义。提示%青梅汁对记忆再现障碍小鼠学习记忆能力有改善作用。研究成果填补了国内该项研究空白,为青梅益智类功能食品的开发提供重要的参考价值。.用气相色谱一质谱联用法对青梅汁进行化学成分分析.共分离出种成分,青梅汁的组成包括:酸及酸酐、醛、酮和酯等,其中酸及酸酐类物质含量最高,为.%;醛类次之,为.%;其它依次为酮类,.%,酯类,.%。实验结果提示在青梅汁主要功效成分中,顺丁烯二酸类和糠醛类物质可能与青梅汁的抑菌作用有关。关键词:青梅汁;抑菌;抗氧化;羟自由基;超氧阴离子自由基;记
4、忆再现障碍;水迷宫;气相色谱.质谱联用;功效成分;分离;鉴定/ ., , ., . .,/ . ., .;.豳: ,%, %,%.。 啷.。. .魑 .%一% .% . , . .%,.%,.%,.%.: ; ; ;独创性声明本人声明,所呈交的学位毕业论文,是我个人在导师的指导下,进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外,论文中不包含其它人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志,都在论文中作了明确的说明并表示了谢意,如被查有侵犯他人知识产权的行为,由本人承担应有的责任。学位毕业论文作者亲笔签名:橡虫日期:卅.筝.论文使用授权的说明本人
5、完全了解福建农林大学有关保留、使用学位毕业论文的规定,即:学校有权送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密,在 口年后解密可适用本授权书。口不保密,本论文属于不保密。晾噎,学位毕业论文作者亲笔签名:日期:埘.;褥;唧.,?弓,指黝亲一:步/厉笏,福建农林大学硕士学位论文 青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定第一章引言青梅的保健功效及开发现状青梅/ .,俗称酸梅、果梅或干枝梅,是梅子的一种,属蔷薇科李属,多年生落叶果树,小乔木。青梅原产我国,是我国亚热带地区特产水果,在我国栽培历史悠久,诗经、山海经、尔雅等古书均有关
6、于梅的记载。福建青梅栽培历史较悠久【】,最早记载梅的是宋朝梁克家的三山志年:“怀安侯官乡户园林种至十万株,盐者为白梅”,可见多年前已有大面积种梅。青梅由于对气候条件要求严格,且开花期很早,在春寒之地往往花而不实,因此适栽范围较窄,国外仅有日本、韩国和泰国等个别国家有商品性栽培,欧洲、美国等栽培较少,且仅供欣赏。在我国作经济栽培仅限于长江以南各省区,长江以北有观赏梅的分布。其中栽培面积以广东、台湾、广西、云南、福建、江苏、浙江较多,湖南、江西、四川、安徽、贵州、湖北、陕西,河南、西藏和香港特别行政区也有分布。青梅具有丰富的营养价值和医疗保健作用。青梅含有大量的蛋白质、脂肪脂肪油、碳水化合物和多种
7、无机盐、有机酸。据资料分析,青梅所含的酸主要是柠檬酸、苹果酸、单宁酸、苦叶酸、琥珀酸、酒石酸等,具有生津解渴、刺激食欲、消除疲劳等功效,尤其是柠檬酸含量在各种水果中含量最多。柠檬酸是人体细胞物质代谢不可缺少的重要酸类,它能促进乳酸分解为二氧化碳和水排出体外,恢复疲劳,且有益于钙的吸收。青梅果实中有机酸含量一般在.%一.%,远远高于一般水果。青梅营养丰富,低糖高酸,其值糖酸比仅为.,是梨的/,杏的/,比柠檬的值还低。其次,它具有合理的钙磷比,其/:,是开发儿童和老年保健食品的最佳食物。.青梅的保健功能据李时珍的本草纲目明确记载,“梅”花开于冬而熟于夏,得木之全气。味最酸,有下气、安心、止咳止嗽、
8、止痛止伤寒烦热,止冷热痢疾,消肿解毒之功效,可治三十二种疾病。神农本草记载,“梅性味甘平,可入肝、脾、肺、大肠,有收敛生津作用”。现代医学研究表明,青梅具有以下功效:.抗肿瘤,清除血液垃圾青梅的果实含有丰富的柠檬酸和苹果酸,酸味极强,这些柠檬酸等有机酸不仅能把血液中积存的乳酸排除体外,而且还能抑制新的乳酸产生,达到清洁血液福建农林大学硕士学位论文青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定的作用,而丰富的又具有防止癌变的作用【】。.显著改善肠胃功能青梅果实具有调节肠胃功能的独特功效。梅实中的儿茶酸能促进肠子蠕动和调理肠子,同时又有促进收缩肠壁的作用,对便秘尤其足孕妇有显着功效。其酸味能刺激唾液腺、胃腺
9、等分泌消化液,促进消化,滋润肠胃,改善肠胃功能,并促进肠道的吸收【】。.消除疲劳,增加活力;延缓衰老,保持美容青梅的果实富含的柠檬酸等有机酸具有增进食欲,恢复体力,消除疲劳等功效。同时能改善便秘,安神,解烦【卯。现代人的饮食习惯大部分偏向于生理酸性食物,容易使血液呈酸性反应,时常感到疲劳,健康状态极易老化,主要由于钙质不能化成离子被身体吸收,乳酸不易排泄嘲。青梅含有丰富的有机酸和矿物质,尤其是含有的钙等能预防老人骨质疏松,是一种典型的生理碱性食品。梅制品能使唾液腺分泌更多的腮腺激素,腮腺激素是一种内分泌素,常被称为“返老还童素”,它可以使血管及全身组织年轻化作用,并能促进皮肤细胞新陈代谢,起到
10、美肌、美发效果;还可促进激素分泌物活化,从而达到延缓衰老的作用。.保护肝脏青梅制品的解毒作用能分解人体内的有害物质,也能解除人体内外部侵人的毒素;同时其含有的硫化合物是一种抗氧化活性的物质,又可抑制脂质过氧化物对膜结构的损伤。青梅果实中含有丙酮酸和齐墩果酸等活性物质对肝脏有保护作用,能提高肝脏的解毒功能,增强人体解食毒、水毒、血毒的能力,故有“人体卫士”之称用。.抗菌、驱虫、抗过敏作用青梅制品对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等多种细菌均有一定抑制作用,对须疮癣菌、絮状表皮癣菌等真菌也有一定的抑制作用,如青梅熏制品乌梅、青梅加工的下脚料梅卤等均报道有广谱抗菌作用【】。.青梅加工产品的开发利用
11、现状青梅作为食品原料,属于特种原料。特种原料是指营养素含量全面、合理或具有多种医疗保健功能的食品,包括全营养食品类和药食两用食品类。青梅属于药食两用食品类。青梅因其鲜果太酸,除少量供鲜食外,绝大多数供加工成果脯、蜜饯、药材和保健食品、美容品等,目前已开发的有个系列梅制品】【】:盐渍类制品:包括咸水梅、梅胚、咸梅干等。是青梅产品出口的主要型态。福建农林大学硕士学位论文青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定蜜饯类制品:梅果蜜饯是青梅加工的传统产品,包括蜜梅、酥梅、话梅、陈皮梅、五香梅等。梅饮料制品:近两年来,日本、韩国对青梅消费出现一个新的动向,越来越多的消费者喜欢饮用纯青梅汁或以青梅汁兑其它饮品如
12、酒、果汁饮料等,且作为高尚饮品。梅酒类制品:以青梅为原料,利用现代生物技术,经发酵工艺酿制,精心勾兑而成的发酵酒。发酵酒又分青梅全果发酵和青梅纯汁发酵,保持了青梅的原有风味及发酵产出的风味。青梅酒生产尚可采用粮食酒直接浸泡青梅果制作而成,果于酒中。梅酒在其人体保健功能、口感、色香味等方面均有其独到之处,足可与葡萄酒相媲美,具有拓展出口外销市场和国内果酒市场的潜力。熏制类制品:此类制品包括乌梅、药用梅粉剂等。乌梅在药用上可以用于治喉痛、咽炎、慢性腹泻、痢疾、肠炎、喘咳、小儿盗汗、崩带漏下,另外还可镇呕、驱蛔虫等。乌梅在医药上一方面用作中药材临床应用;另一方面利用乌梅为原料制成的。虎杖冲剂”、“乌
13、梅安胃丸”、“乌梅饮”等药品达二十多种。乌梅在福建上杭为传统药用佳品。护肤美容制品:青梅加工中的乌梅干能使唾液腺分泌更多的腮腺激素,腮腺激素具有使血管及全身组织年轻化作用,并能促进皮肤细胞新陈代谢,有美肌、美发效果。天然植物抑菌效应的研究进展植物是抑菌活性物质的天然宝库。据年的资料,全世界已报道过多种具有控制有害生物的高等植物,其中抗真菌的有种,抗细菌的有种,抗病毒的有种【。等年报道有种植物将有可能作为杀菌剂,和年报道约有种植物具有防治有害微生物的活性【】。.植物抑菌活性的研究进展近年来,国外科学工作者对植物抑菌活性做了大量研究。等试验表明,葱和的叶提取物对有活性:研究表明欧洲小蘖、山黄连对灰
14、葡萄孢有生物活性;等研究发现,大蒜、洋葱和姜提取物对豌豆白粉病具很高活性【】;等研究表明,桉树、大蒜、金盏花、春黄菊、荨麻能有效抑制葱白腐小菌核菌生长【】;等研究发现,番荔枝、银胶菊提取物对菜豆壳球等从甜菜叶孢有生物活性【】;福建农林大学硕士学位论文 青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定的生长:分离出蛋白,能有效抑制甜菜尾孢等研究表明玫瑰草油对丝核菌有活性【珀;等试验表明丁香罗勒、斑鸠菊、芒果提取物对串珠镰刀菌有活性【;等研究表明皱皮欧芹和芸香提取物对等实验表明,两种重要的药用植立枯丝核菌有很高活性【加】;物姜 疖和菖蒲;的根茎粉末对 有活性;等研究表明牛膝草精油对稻瘟病菌有活性埘。近年来,我
15、国科学家对植物的抑菌活性也做了相关研究。喻大昭等测定了种植物提取物对种植物病原真菌抑菌活性,结果表明欧时萝、白香、滇香、两面针、土荆芥、香茅、莴缕子、窄叶阴香、九里香、肉桂等植物提取物具有较强的广谱抑菌活性【冽;西北农林科技大学无公害农药研究服务中心对采自西北地区的种植物样品提取物进行了抑菌试验,综合分析表明苦豆子、石榴、大花金挖耳等十余种植物具有明显的开发研究价值;李永刚等研究表明,由苦参、黄柏、蛇床子等余种中药组成的混剂离体和活体活性均较好;操海群等发现毛金竹、毛竹、青皮竹等均表现较强的抗真菌作用捌.胡建军等研究了石榴皮、甘草、红枣叶、侧柏叶、山楂叶、核桃叶等植物提取物对金黄色葡萄球菌、大
16、肠杆菌的抑菌效果。结果表明:六种植物提取物中,石榴皮的抑菌效果最好,其次是侧柏叶、核桃叶,红枣叶、山楂叶较弱,甘草抑菌活性最弱。庄惠如等研究了福建福州种蕨类植物抑菌活性,其中鳞毛蕨科个种显示出较强的抑菌能力【。目前对植物抑菌活性的研究大部分集中在十字花科、菊科、豆科、唇形科、茄科等植物中。我国植物资源丰富,随着保护环境、维护生态及人类健康的需要,和生物、信息、分离鉴定和仪器分析等技术的发展,对植物抑菌活性的研究将会不断地深入。.青梅抑菌活性的研究进展青梅抑菌活性的研究目前多集中于对其熏制品乌梅的研究。乌梅是成熟青梅的熏制品,药食兼用,乌梅在药用上可以用于治喉痛、咽炎、慢性腹泻、痢疾、肠炎、喘咳
17、、小儿盗汗、崩带漏下,另外还可镇呕、驱蛔虫等。全国中草药汇编中记载:乌梅及其制剂在体外对大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、霍乱杆菌、百日咳杆菌、变形杆菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、溶血性链球菌、绿脓杆菌均有抑制作用,而且对苍须癣菌等真菌也有一定的抑制作用。吴传茂等报道乌梅酸性水提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆福建农林大学硕士学位论文 青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定菌等细菌有很强抑制力,对真菌中的青霉菌也有一定的抑制作用。且乌梅酸性水提取液热稳定性强,与糖、与盐有明显的协同抑菌作用【。对乌梅抗菌机理的研究,有人认为是多数致病菌在.范围内生长最好,酶的
18、活性度高,生长繁殖旺盛,若将其置于小于的环境下,则大多数致病菌难以存活。体外抑菌实验也证实,乌梅所含有机酸的抑制作用确实强于有机酸盐,但从乌梅水溶液总的作用来看,乌梅的总酸度只是影响抑菌作用的一个方面,可能还有别的化学成分相协同【州。有关青梅原果抑菌活性的研究未见报道。果蔬抗氧化的研究进展大量的流行病学资料表明,蔬菜、水果的摄入量与心脑血管病以及一些肿瘤的发病率、死亡率呈负相关关系,由于自由基造成的氧化损伤与上述疾病的发生发展有着密切关系,而蔬菜、水果中含有大量己知和未知的抗氧化物质。因此,人们推测蔬菜、水果中的抗氧化物质对于预防上述疾病的发生发展有着重要意义。.果蔬抗氧化作用的可能机理清除活
19、性氧自由基。已有大量证据证明,水果蔬菜均有一定的清除氧自由基的能力,这可能是其抗氧化作用的第一道防线。增强抗氧化酶活性。水果蔬菜可通过增强抗氧化酶活性而保护机体免受氧化损伤。阻断脂质过氧化链式反应,减少膜脂质过氧化损伤。不少水果蔬菜可抑制过氧化产物及脂褐素的生成。减少损伤。自由基学说认为,过剩的自由基可以攻击,引起损伤,从而引发多种疾病。对水果蔬菜抗氧化作用的研究目前已有个别深入到分子水平.果蔬的主要抗氧化物质果蔬中含有许多不同的抗氧化物质,可清除含氧自由基,这些物质除了维生素生育酚、维生素抗坏血酸、.胡萝素、类胡萝素外,最近的研究发现西红柿红素、类黄酮、花青素及儿茶素等可能含有更高的抗氧化活
20、性【。茄红素:茄红素在红西红柿、西瓜及红葡萄等中较丰富,其中以红西红柿的含量晟高/,其构成为一个特殊的长链分子,含个双键,是类胡萝素中双键含量最高的。这一构造使其具有比.胡萝素及其类胡萝福建农林大学硕士学位论文 青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定素更强的清除自由基及终止单线态氧活性的能力。其顺式异构物的吸收比反式更容剔鲳。类黄酮:果蔬中的类黄酮主要包括黄酮、黄烷酮、黄酮醇、黄烷醇】、异黄酮以及花青素配基等,通常以糖苷形式存在【剪。类黄酮的抗氧化机制包括去除自由基及活性氧分子;利用螯合能力抑制金属离子,与蛋白质形成复合物,还原氧化的维生素或维生素以显示加乘效果,类黄酮可以经由螫合方式连结一个或
21、二个铜原子而抑制含铜酶如抗坏血酸氧化酶、多酚氧化酶等。不同类型的果蔬都含有其特殊的类黄酮,如柑桔类主要是黄烷酮;葡萄则属黄烷醇,主要为儿茶素及表儿茶酚【柏。花青素:花青素是属于黄酮家族的天然色素,广泛存在于水果、蔬菜之中。葡萄及其加工产品是花青素的重要来源。花青素为水溶性,与糖类形成糖苷。等探讨种花青素的抗氧化活性发现.活性最高,约为维生素的.倍,最低【。桑椹含有大量的矢车菊素及花翠素,其萃取液可用于治疗微血管疾病以及维持正常的血管渗透性,亦可防止胆固醇引起的动脉硬化】。不同品种葡萄所含总酚类物质的差异相当大,深色葡萄品种的黄酮类物质含量较高,其抗氧化活性也较白色及浅白色葡萄为高。因此,红葡萄
22、酒对氧化的抑制效果也比白葡萄酒高出许多。等最近发现葡萄的萃取液及其所含的花青素具有防止胃溃疡的生理功能。究其原因可能在于花青素低聚合物具有清除自由基的抗氧化活性,可使胃壁不受自由基引起的伤害:同时花青素可与蛋白质紧密结合而具有保护胃壁的功能。.青梅抗氧化活性的研究进展青梅抗氧化活性的研究目前多集中于对其熏制品乌梅的研究。乌梅对邻苯三酚及肾上腺素氧化系统产生的氧自由基有很强的消除能力,并在垂直凝胶电泳中表现出抑制氮蓝四唑光化还原的能力【。将乌梅加工成汁喂养小鼠,能显着降低成年小鼠肝、血水平和提高小鼠脑、血活性。体外实验表明,青梅果浆有明显的抗氧化溶血和抗肝匀浆脂质过氧化作用,且抑制率和剂量呈正相
23、关【删。而青梅原果清除自由基能力及其抗氧化活性的研究未见报道。改善记忆功能学的研究进展学习和记忆是动物和人赖以生存的重要脑功能之一。学习主要是指人或动物福建农林大学硕士学位论文 青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定通过神经系统接受外界环境信息而影响自身行为的过程,记忆是指获得的信息或经验在脑内储存和提取再现的神经活动过程【。.改善记忆功能学的研究方法研究方法有基于行为学研究的跳台法、避暗法、穿梭箱、迷宫法等。学习记忆能力是目前实验室中反映动物智力水平的最可靠指标,因此几乎所有益智实验都选取了行为学指标。常用的行为学实验方法主要有类:经典条件反射包括主动和被动类;回避性条件反射较少;操作式条件反
24、射较多;辨别性学习如空间、时间、形状辨别学习等。其中水迷宫实验,及其它行为学实验是近十几年建立起来的判断动物学习记忆能力的重要试验方法,近年来正成为神经药理学,神经生理学,神经心理学,老年病学等的常用研究手段,现在国际上广泛采用。该法操作简便,方法可靠,利用计算机建立图象自动采集和分析系统,制得相应的直方图和运行轨迹图,研究者可以对实验结果作进一步分析和讨论【。.改善记忆功能相关产品的研究现状由于中药具有多途径、多靶点的特点,在益智方面的研究受到高度重视。中医认为,脑为元神之府,脑的智能以精、气、神为基础,与心、肾、脾诸脏有关.心主神明,肝藏血,肝肾同源,肾藏精,精生于髓,髓上充于脑,心气血不
25、足,肾精气亏损,脑髓海失充,均会引起记忆力减退。凡能调动全身五脏六腑的精气。上行于头,使脑髓充养而主神明的中药皆有益智功效。近年来中药益智作用的研究包括单昧药、提取物、复方等,以补益类中药为主【,如银杏叶、草苁蓉、石菖蒲、党参、人参、芍药等。这些补益药通过不同的作用部位即靶点改善大脑血循环,促进大脑神经元形态的修复,达到益智的作用【。目前,市场上中药型的益智药品占绝大多数,而对天然果蔬的益智保健作用的研究少有报道。本项目研究的目的、意义及创新性青梅是典型的具有保健功能的生理碱性食品,传统加工品如干湿梅、梅脯、蜜梅等深受国内消费者的喜爱,特别是日本、韩国,本国生产的青梅远远满足不了消费需求,依赖
26、中国大陆进口青梅制品。因此青梅作为一种重要的特色资源具有很高的市场开发价值,目前国内对青梅的开发主要集中于蜜饯产品或咸胚半成品,产品形态单一,无法充分利用青梅的保健价值,这严重制约了青梅产业的发展。随着消费者健康意识的不断提高,人们己不满足于青梅粗加工产品的消费。福建农林大学硕士学位论文青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定因此,有效地利用青梅这一天然植物的特殊功效,开发适合健康消费潮流的产品,丰富青梅深加工产品品种成为当务之急。本项目系统研究了青梅抑制细菌和清除自由基的能力;阐明青梅抑菌和抗氧化活性,该研究成果对提升青梅产业价值,拓展青梅深加工途径具有重要的理论和实践价值;研究了青梅汁对小鼠记
27、忆力障碍的改善作用,为青梅益智类功能食品的开发提供重要的参考价值,研究成果填补了国内该项研究空白,具有重要的实践应用价值。在此基础上,采用气相色谱和质谱联用仪定性和定量分析青梅汁的功效成分及其含量,为进一步了解青梅小分子物质与其生物活性关系提供理论基础,为青梅保健作用及其机理的深入研究提供理论依据。福建农林大学硕士学位论文 青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定第二章青梅抑菌作用的研究摘要:本文研究了青梅的抑菌作用。结果表明:青梅汁对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种菌种均有抑制作用。且青梅汁经高温处理后,仍具有较强的抑菌作用。青梅汁对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为%,对大肠杆菌的最低抑
28、菌浓度为%,对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为%。关键词:青梅汁;抑菌作用微生物是自然界生态平衡中一个必要的组成环节。但细菌、病毒、霉菌和酵母菌等也导致了许多微生物危害,如感冒,胃肠炎、皮肤疮疡及口腔炎等疾病,大多与细菌及病毒感染有关。日常饮食中有不少食品具有杀灭致病性微生物的功效,能起到消炎杀菌、抗病毒及驱虫作用矧。研究表明青梅的熏制品乌梅具有具有广谱杀菌、抑菌作用,对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌有很强抑制力,对真菌中的青霉菌也有一定的抑制作用】。而青梅原果抑菌活性研究未见报道。青梅是南方的特色果品资源,但目前国内对青梅的开发主要集中于蜜饯产品或成胚半成品等粗加工产品,产品形态
29、单一。为了多元化地开发青梅产品,拓展其深加工途径,本文研究了青梅对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑制功效,以及其最低抑菌浓度,以期为开发青梅抗菌消炎保健产品提供理论依据。材料与方法.材料青梅:永泰产,福州大世界天然食品有限公司青梅标准化生产基地提供。;大菌株:标准株:金黄色葡萄球菌肠杆菌 ;枯草芽孢杆菌.分别简写为、,以上菌种由福建农林大学食品科学学院微生物实验室提供。主要药品:平板菌落计数培养基,杭州微生物试剂厂产品;氯化钠、尼泊金乙酯钠、柠橡酸均为国产分析纯。.主要仪器设备一系列数显电热培养箱:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;电热鼓风干燥箱:.型,上海阳光实验仪器有限公司;新华牌
30、型电热式蒸汽消毒器;高速组织捣碎机:.型,上海标本模型厂;福建农林大学硕士学位论文 青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定精密计:.型,上海精密科学仪器有限公司;紫外可见分光光度计:型,尤尼柯上海仪器有限公司:梅特勒.托利多.电子天平:梅特勒托利多仪器上海有限公司。.实验方法.青梅汁及其它试剂的制备方法.青梅原汁和清汁的制备方法青梅去皮去核,打浆,用目尼龙筛网过滤,滤液加热到,保持,得青梅原汁,原汁经.膜过滤,得青梅清汁,用精密计测定,.,置于冰箱内冷藏,备用。.无菌.%生理盐水配制方法:称取.于锥形瓶中,加蒸馏水溶解,放入少许沸石,湿热灭菌,备用。.无菌柠檬酸溶液配制方法将柠檬酸用蒸馏水调配成
31、柠檬酸溶液,使其值等于青梅汁的值,湿热灭菌,备用。.无菌尼泊金乙酯钠溶液制备方法:称取.尼泊金乙酯钠,用蒸馏水定容至,得.%尼泊金乙酯钠溶液,湿热灭菌,备用。.菌体的培养方法.培养基制备方法取平板菌落计数培养基于蒸馏水中,加热至溶解,.,灭菌,待冷却至左右,倾注无菌平皿。.无菌小滤纸片制取方法用打孔器打出直径约为的小滤纸片多张,干热灭菌,备用。.菌种活化方法每次抑菌实验前,将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌三种菌种分别接种于试管斜面培养基,置于恒温培养箱,培养。.菌悬液制备方法用接种环挑取两环菌体放入装有沸石的无菌生理盐水里,充分振荡,制成菌体悬液。由于细菌悬液的浓度与光密度值成正比,因
32、此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度值。将菌悬液倾倒入比色杯中,选用波长,以无菌生理盐水作为空白对照,采用比浊法测定三种菌悬液的浓度值,调整菌悬液的浓度,使每次实验所用的三种菌悬液福建农林大学硕士学位论文 青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定的浓度基本保持一致。.青梅汁抑菌活性的测定将每个无菌平皿分为两个区域。用移液管分别吸取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌菌悬液.于平板上,用无菌三角玻璃涂棒涂布均匀。用无菌镊子将分别沾有青梅原汁和青梅清汁小滤纸片分别轻贴于平板上两个区域中心,待干后,倒置于恒温培养箱,培养。最后测定抑菌圈直径大小。同上,采用抑菌圈实验方法,将每个无菌平皿
33、分为四个区域,比较同等酸度的柠檬酸溶液和尼泊金乙酯钠溶液与青梅清汁的抑菌效力,并以蒸馏水作为空白对照。.值对青梅汁抑菌活性的影响【叼用和配制五个梯度的缓冲溶液,并用这五种缓冲溶液制备培养基,使培养基的初始分别为、。将小滤纸片置于青梅清汁中浸泡,?干,放入平板中。倒置于恒温培养箱,培养。最后测定抑菌圈直径大小。.青梅汁抑菌作用的热稳定性试验将青梅清汁置于,和温度条件下,热处理后,将小滤纸片分别置于不同热处理过的青梅清汁中浸泡,?干。放入平板中。倒置于恒温培养箱,培养。最后测定抑菌圈直径大小。.青梅汁最低抑菌浓度的测赳碉用蒸馏水将青梅清汁进行一系列浓度稀释,体积浓度分别为%、%、%、%、%、%、%
34、、%、%、%,并将值调到中性范围。同时设空白对照组。用各种不同浓度的青梅汁制备培养基,倾注无菌平皿。冷却后,用无菌移液管吸取.菌悬液至平板上,用无菌三角玻璃涂棒涂布均匀,待干后,倒置于恒温培养箱,培养。然后观察结果,以完全没有菌生长的最低浓度为青梅汁对该菌的最低抑菌浓度。结果与分析.青梅汁抑菌活性测定结果.青梅原汁和青梅清汁的抑菌活性对比青梅原汁和青梅清汁的抑菌活性对比结果如附图所示,图中区域为青梅原汁,区域为青梅清汁,结果见表.。由表可知青梅原汁和青梅清汁对试验的三种菌的生长均有抑制作用,且福建农林大学硕士学位论文青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定两者的抑菌活力相近。利用统计分析软件对数据
35、进行分析,结果如表。表原汁与清汁的的抑菌效力注:“”表示平均值。:“.表数据统计分析检验可知,青梅原汁和青梅清汁对金黄通过表.的.色葡萄球菌抑制活力比较中,.,.,方差是齐性的;青梅原汁和青梅清汁对大肠杆菌抑制活力比较中,.,.,方差是齐性的;青梅原汁和青梅清汁对枯草芽孢杆抑制活力比较中,.,.,方差是齐性的。说明青梅原汁和青梅清汁对这三种菌的抑制效力无明显差异。青梅清汁是原汁去除大分子物质所得,因此实验可证明青梅汁的抑菌能力与其大分子无关。.青梅清汁与柠檬酸、尼泊金乙酯钠的抑菌效力对比实验选用防腐剂与青梅清汁的抑菌效力做对比。目前,国内比较常用的防腐福建农林大学硕士学位论文青梅功能学研究及其
36、功效成分的分离鉴定剂有苯甲酸钠、山梨酸钾、丙酸钙和尼泊金乙酯等,但尼泊金乙酯不溶于水,所以通常使用它的钠盐。苯甲酸钠在酸性条件下对细菌生长抑制效果好,其值为.?.时抑菌效果最好,不符合本实验要求:山梨酸钾对细菌作用弱,在?以下酸性介质中抑菌效果好,也不符合本实验要求;丙酸钙显碱性,%水溶液的值为,对细菌作用弱,同样不符合本实验要求;而尼泊金乙酯钠在 范围内均有良好的抗菌作用,符合要求。综上可知,只有尼泊金乙酯钠的作用范围将这三种菌生长的适宜范围都包括在内,因此本实验选用尼泊金乙酯钠与青梅清汁抑菌效力作对比。李海林等人报道】:青梅有抑菌作用主要是由其酸度作用。青梅中的有机酸主要是柠檬酸,因此本实
37、验选用与青梅汁同等酸度的柠檬酸溶液与青梅汁抑菌效力作对比。柠檬酸溶液、尼泊金乙酯钠溶液与青梅清汁的抑菌效力的对比结果如附图所示,图中区域为蒸馏水空白对照,区域为柠檬酸溶液,区域为青梅清汁,区域为尼泊金乙酯钠溶液,结果见表。表四种溶液的抑菌效力. 注:“一”表不无抑菌作用。:“ .由表.可知:与青梅汁同酸度的柠檬酸溶液对试验的三种菌完全没有抑制作用;而尼泊金乙酯钠对枯草芽孢杆菌的抑制作用较弱,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌完全没有抑制作用。由实验可知:同酸度的柠檬酸并没有抑菌作用。所以可以确定青梅汁的抑菌作用与其酸度无关,可能是由其内在小分子起作用。福建农林大学硕士学位论文 青梅功能学研究及其功效成
38、分的分离鉴定.值对青梅汁抑菌效力的影响金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及枯草芽孢杆菌在和时不能生长。本实验对比了值在条件下青梅清汁的抑菌效力,结果见表。表不同值对青梅汁抑菌效力的影响 注:。/”表不无菌生长,“一”表不无抑菌作用。:。/.。一” .由表可知,金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及枯草杆菌在和时不能生长。在范围内,青梅清汁对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的生长均有一定的抑制作用,而且不同值条件对青梅清汁的抑菌效力影响不大。在和的条件下,青梅清汁对枯草杆菌有抑菌作用,但时青梅汁对枯草杆菌没有抑菌作用。.青梅汁热稳定性试验通过、三种温度热处理,青梅清汁对三种细菌抑菌效果如附图所示,图中区域为,区域为,区域为,
39、结果见表.。表热处理对青梅汁抑菌效力的影响注:。”表示平均值。福建农林大学硕士学位论文 青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定:“.由表.可知,青梅汁经种温度处理后,仍具有很强的抑菌力。利用统计分析软件对数据进行分析。采用.两两比较法,进行青梅清汁在,和三种温度下对三种细菌抑菌圈的均数比较。结果见表。表数据统计分析由表可知,在,和三种温度处理下,青梅清汁对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制效力变化不大。说明高温处理不会影响青梅清汁的抑菌效力。.不同青梅汁浓度对抑菌效果的影响%、%、%、%、%、%、%、%、%、%十个体积浓度梯度青梅清汁对三种细菌的抑制效果如附图、所示,并测定出其最低抑菌
40、浓度。结果见表.。表青梅汁的最低抑菌浓度测定结果注:“”表示有菌落生长,“一”表示无菌落生长。:“ “由表可知,随着青梅汁浓度的增大,抑菌作用逐渐增强。青梅清汁对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为%, 对大肠杆菌的最低抑菌浓度为%,对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为%。福建农林大学硕士学位论文青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定讨论.青梅汁对试验的三种菌的生长均有较强的抑制作用,其抑菌功效是由其内在成分引起的,而非其酸度作用。.在范围内,青梅汁对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的生长均有一定的抑制作用。在和的条件下,青梅汁对枯草杆菌有抑菌作用,但:时青梅汁对枯草杆菌没有抑菌作用。.青梅汁抑菌效应的热稳定性较好
41、,高温处理不会影响青梅汁的抑菌能力。.青梅汁对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为%,对大肠杆菌的最低抑菌浓度为%,对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为%。福建农林大学硕士学位论文青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定第三章青梅抗氧化活性的研究摘要:本文利用反应研究青梅清汁清除?的作用;利用邻苯三酚自氧化法研究青梅清汁清除?.的作用。同时以茶多酚做阳性对照。结果表明:青梅清汁能有效地清除羟自由基和超氧阴离子自由基,且在实验浓度范围内,其清除能力随浓度的增大而增强。青梅清汁清除羟自由基的能力较强。关键词:青梅清汁;抗氧化;羟自由基;超氧阴离子自由基近年来的研究表明,许多疾病的发生发展与自由基有密切关系。自由基
42、是生物体中生化反应的普遍中间介质或称非特异性调节剂,在正常生理情况下活性氧的产生与清除可维持在一个有利无害的极低水平,但在衰老、应激和疾病的情况下却发生活性氧对重要生物分子的损伤。当人体内的自由基产生过多或清除过慢,羟自由基?和超氧阴离子自由基?是生物体内主要的活性氧自由基,由它所引起的体内脂质过氧化是人类疾病发生和衰老的重要原因。因此清除过量活性氧自由基具有重要的生理意义【卅。寻找对自由基具有良好清除能力的清除剂,特别是从常见的食品资源中进行筛选,是一个极有意义的研究课题。故此,本文从羟自由基?和超氧阴离子自由基?角度,对青梅汁的清除自由基能力进行了研究,以期对青梅的营养价值及进一步综合开发
43、利用提供科学理论依据。材料与方法.实验材料原料:青梅:同第二章.;青梅清汁,同第一章.:试剂:乙醇,三氯乙酸,浓硫酸,.脱氧核糖,硫代巴比妥酸均为分析纯;.主要仪器型紫外可见分光光度计,尤尼柯上海仪器有限公司;.型数显恒温水浴锅,国华电器有限公司。.实验方法.清除羟自由基能力的测定采用体系】踟。利用体系产生的羟自由基,分析羟自由基对.脱氧核糖分子的氧化,破坏情况。确定样品提取物的存在是否对羟自由基有清除作用,保护.脱氧核糖分子不被氧化。整个反应过程用下列反应式表示:“一”一福建农林大学硕士学位论文 青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定?脱氧核糖一氧化产物氧化产物?鱼?有色化合物茶多酚是目前使用
44、较广泛的一种抗氧化剂。本实验以茶多酚做阳性对照,比较茶多酚与青梅清汁的抗氧化活性。实验方法如下:取. .混合液?于试管中,加入.的.脱氧核糖溶液?,然后加入不同体积的青梅清汁分别为.、.、.、.、.,另外设置不同体积的 /茶多酚溶液分别为.、.、.、.、.,.?定容至. ,再.做为阳性对照。用磷酸缓冲液加入. ?,混合后置于恒温水浴中反应,然后依次加入.%质量百分比三氯乙酸溶液.,.%质量百分比硫代巴比妥酸溶液.,混匀后置沸水浴反应,冷却后用分光光度计在波长处测吸光度。不加青梅清汁,同上操作处理,测定其对比吸光值;不加青梅清汁并且不在沸水浴中反应,其它处理同上,测定空白吸光值.加入青梅清汁若有
45、清除?的作用,则能抑制氧化产物的生成,吸光度则相对比吸光值减少,青梅清汁的羟自由基清除能力%可表示为:%/?.清除超氧阴离子自由基能力的测定【删采用邻苯三酚自氧化法。取./.缓冲液.,分别加入不同体积的青梅清汁分别为.、.、.、.、.,另外设置不同体积的/茶多酚溶液分别为.、.、.、.、.做为阳性对照。用蒸馏水定容至,混匀,下保温后加入./邻苯三酚,计时,摇匀,准确反应后,加入舢溶液.,终止反应,在下测定吸光值。清除率%./:不含有待测物的反应液于的吸光度值;:含有待测物的反应液于的吸光度值。结果与分析.青梅清汁对羟自由基的清除作用比较青梅清汁与茶多酚在反应体系中,对?的清除能力。实验结果见表和图。结果显示:青梅清汁与茶多酚对?氧化“均有一定的抑制作用,且对?清除率随着浓度的增加而增强。相对于茶多酚而言,青梅福建农林大学硕士学位论文 青梅功能学研究及其功效成分的分离鉴定清汁对?具有更强的清除能力,且清除率随浓度变化更明显。实验证明:青梅清汁具有清除?的活性,且在实验浓度范围内,青梅清汁清除?的活
