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1、Polymerase Chain Reaction（PCR),聚合酶链反应,Department of biochemistry and molecular biology,DNA，生命的蓝图,引物酶,引物酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,故事发生在1983年的春夏之交,Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，,Mullis的第一个PCR实验,1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加 入DNA聚合酶后在37 一直保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加
2、入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。,Kary B.Mullis,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,由一对引物介导,通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶使引物延伸而成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过2030个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。又称为无细胞分子克隆
3、技术、基因扩增技术或DNA扩增技术。Pg水平至ng水平。,第一节 PCR基本原理,一、PCR的基本原理,DNA体外的快速扩增技术,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模
4、板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数,第二节、PCR的过程,（一）DNA模板的解链（变性）90 95，30s 理论上，在90 左右能使DNA双链之间的所有氢键链断开，完全分离为单链；且在中性pH情况下，DNA的完整性仍能很好保存。,（二）DNA 单链与引物的退火（复性）55 65,3045s 引物与模板单链特异性结合（较高的温度）；不希望两条互补的模板单链结合在一起（DNA引物的量大大超过模板的量，竞争性结合：引物+模板几率DNA自身复性几率）;,（三）
5、引物的延伸（新链DNA的合成）7075，3060s（2kb)首次循环：引物从3端开始延伸，延伸片段的5端为人工合成引物是特定的，3端没有固定的终止点，长短不一。第二个循环：引物与新链结合，由于后者5端序列是固定的末端，意味着5端的序列就成为此次延伸片段3端的终止点。N个循环后：由于多数扩增产物受到所加引物5端的限定，产物的序列是介于两种引物5端之间的区域。引物本身也是新生DNA链的一部分。,Synthesis by DNA polymerase-A T G C A T G C A T G C*,A,C,G,-T,Polymerase Chain Reaction-PCR,Specific sh
6、ort DNA primer anneals to strand to be copied,5,3,Synthesis by DNA polymerase-A T G C A T G C A T G C*,A,C,G,T,-T,Polymerase Chain Reaction-PCR,5,3,Synthesis by DNA polymerase-A T G C A T G C A T G C*,A,C,G,T,-T,A,Polymerase Chain Reaction-PCR,5,3,Synthesis by DNA polymerase-A T G C A T G C A T G C*
7、,A,C,G,T,-T,A,C,Polymerase Chain Reaction-PCR,5,3,Synthesis by DNA polymerase-A T G C A T G C A T G C*,A,C,G,T,-T,A,C,G,Polymerase Chain Reaction-PCR,5,3,Synthesis by DNA polymerase-A T G C A T G C A T G C*,A,C,G,T,-T,A,C,G,T,Polymerase Chain Reaction-PCR,5,3,Synthesis by DNA polymerase-A T G C A T
8、G C A T G C*,A,C,G,T,-T,A,C,G,T,A,Polymerase Chain Reaction-PCR,5,3,高度的特异性：引物的限定，高温扩增。高度的敏感性：微量样品（单拷贝基因、单个细胞、一根头发等），高效性（X106）。操作简便快速，易于自动化、程序化，方法稳定。对标本的纯度要求底：纯化或粗制的，新鲜或陈旧的，各种细胞，体液，完整的或降解的DNA。,PCR技术的特点,特异性强,PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。,灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能
9、将皮克(pg)量级的起始待测模板扩增到微克(g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。,简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。,对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。,PCR反应,第
10、三节、PCR扩增的基本方法,（一）PCR反应体系1.仪器 台式微量离心机 基因扩增仪 微量塑料离心管：0.5ml或1.5ml（经高压灭菌）微量加样器（pipetman）：20P、200P、1000P，电泳仪及电泳槽、紫外摄影装置、乳胶或塑料手套、Tip若干,PCR,Agarose gel electrophoresis,The final product,UV visualisation,3-4 hours,2.试剂与试样：一般选用50100l体积，模板核酸（template如：人基因组DNA 0.1g)扩增引物（primer一对,各0.21mol/L）TaqDNA聚合酶（2.5U）dNTP（
11、四种：各20200mol/L)标准的缓冲液：10X buffer（KCl、Tris-HCl、MgCl2、BSA或DDT）无菌双蒸水或三蒸水 石蜡油或矿物油:3050ul（封闭、防止高温时液体的挥发）,2.PCR反应试剂,（1）模板 单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,（2）引物浓度 0.2-1 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶
12、量过少影响反应产量。,（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。,（5）Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,PCR反应体系,1、10PCR buffer 10l 2、dNTP mix 各200mol/L 3
13、、引物1 1mol/L 4、引物2 1mol/L 5、DNA模板 50ng-1g 6、Taq 酶 2U 7、加双蒸水至总体积为100l,（二）常规PCR的反应条件 预变性：94 300s（高温起动:充分变性，防止非特异性扩增）变性：90-95，30s-60s 退火：55-65 30s-45s 延伸：70-72 30-60s（2kb)25-35次cycle后，延长延伸（72，10min；充分延伸),冷却至4 或加入EDTA至10mmol/L以终止反应。,（三）PCR基本操作程序1.加样(1)向一微量eppendorf离心管（壁薄、管底扁平、深度适宜）中依次加入：10 x PCR buffer、d
14、dH2O、dNTPs、Primers；102-105个copy 的DNA样品；Taq DNA聚合酶0.5l（混匀后,离心）；加入石蜡油。2.上机：设置循环程序，进行扩增。3.PCR产物电泳：凝胶的制备；点样与电泳；观察结果；作好记录或摄影，保存好实验结果。,（四）PCR 扩增产物的分析,Gel electrophoresisRestriction endonucleaseMolecular hybridizationNucleic acid sequence,PCR扩增产物的电泳分析,琼脂糖凝胶电泳常用于临床检测（定性）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中可用于科研及检测分析,琼
15、脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等,琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围,电泳缓冲液,常用三种缓冲液 Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的 ED
16、TA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解,核酸电泳的指示剂,指示剂：溴酚兰二甲苯青溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段,核酸电泳的染色剂,溴化乙锭（ethidium bromide，EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5g/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察,酶切分析
17、,根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶进行酶切酶切产物电泳分离后，获得符合理论的片段此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究,PCR-RFLP,分子杂交,检测PCR产物特异性的有力证据检测PCR 产物碱基突变的有效方法主要的杂交 Southern印迹杂交斑点杂交,Southern印迹杂交：,在两引物之间另合成一条寡核苷酸链并作标记（探针）与 PCR 产物杂交此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测 PCR产物的灵敏度。,斑点杂交：,将PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上寡核苷酸探针杂交观察有无着色斑点主要用于 PCR产物特异性鉴定及变异分析,RDB检测-地中海贫
18、血突变基因,-29（AG）-28（AG）17（AT，AAG TAG）E（CD26 GAG AAG）IVS-I-1（GT）IVS-I-5（GC）27-28（+C）41-42（-CTTT）43（GT）71-72（+A或+T）654（CT）,微孔板夹心杂交法,通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异性杂交，使PCR产物间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域特异性杂交，漂洗后显色即可判断结果该法使用了两个杂交过程来检测一个产物，其特异性较一次杂交的检测法高,Principle,：NOS（11014/cm2）N-羟化琥珀酰亚胺酯,Princi
19、ple,-CCCCCC,Capture Probe:,：NH2,Detection Probe:,：Biotin,：NH2标记的探针,：Biotin标记的探针,Avidin-HRP 显色系统,：NOS基团,Principle,PCR-ELISA法：,本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测5端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列，因此，可以通过修饰其中一个引物的5端使其携带便于PCR产物固定的功能基团，而通过另一引物5端的修饰使产物便于检测,Sequence,The specific method should be ROBUST Re-optimise for each s
20、et of primers,第四节 PCR的优化OPTIMISE PCR CONDITIONS,X,Optimising the PCR Reaction,Starting nucleic acid-DNA/RNATissue,cells,blood,hair root,saliva,semen Thermo-stable DNA polymeraseOligonucleotides primersThe concentration of Mg2+in the reactionThe annealing temperature,（一）DNA聚合酶(最关键因素之一)1、Taq-DNA聚合酶的热稳
21、定性及最适延伸温度 在7080具有最高聚合活性，高温时仍比较 稳定。所以7080为其最适延伸温度，则退 火和延伸反应温度可提高，限制了非特异性扩 增产物的出现，增加了PCR的特异性。,2、Taq-DNA聚合酶的功能 有53聚合酶活性 有53外切酶活性 无35外切酶活性 Taq-DNA聚合酶Taq DNA酶的聚合出错率较高（2.1X10-4），然而通过优化反应条件，可使Taq酶的聚合出错率降低到原来的1/3。若要细胞克隆PCR扩增的产物，进行表达，扩增后必须测序证实才可使用。,3、激活剂与抑制剂Taq-DNA聚合酶：其活性需要Mg2+。Mg2+的精确浓度主要取决dNTP浓度Mg2+浓度过高导致非
22、特异扩增。一般常用1.5mmol/L,4、其他耐热DNA聚合酶Tth DNA聚合酶（Thermus thermophilus）：在较高的温度下仍具有逆转录酶活性，因此能很好地克服RNA链中普遍存在二级结构的难题。Vent DNA聚合酶：具有校读功能，具有相对较好的高保真性。Sac DNA聚合酶：FD DNA聚合酶：,（二）引物（寡核苷酸引物）引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物的作用：决定PCR扩增产物的特异性与长度，决
23、定PCR反应的成败。,PCR引物的设计一般原则,引物长度一般以1830bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。引物间退火温度相差不要超过5。避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在4060%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。,Avoid repeat sequences,5,5,3,3,no target PCR product,PCR,hairpin loop formation,5-NNNNNNNNNNNGCATGC-3
24、5-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3,5-NNNNNNNNNNNGCA 3-CGT,5,3,要避免两个引物间特别是3末端碱基序列互补以及同一引物自身3末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。引物3末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3末端为G、C或T时引发效率较高。引物5末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。,Avoid repeat sequences,5,5,3,3,5,5,3,3,primer dimer
25、,PCR,3 repeat,5-NNNNNNNNNNNNNTATA-35-NNNNNNNNNNNNNTATA-3,5-NNNNNNNNTATA-3 3-ATATNNNNNNNN-5,Avoid repeat sequences,5,5,3,3,no extension,PCR,5 repeat,5-TATANNNNNNNNNNNNN-35-TATANNNNNNNNNNNNN-3,5-TATANNNNNNNN-33-NNNNNNNNATAT-5,5,5,3,3,其他：简并引物：多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。嵌套引物（巢式PCR）：使DNA序列得到有效的选择性扩增。
26、,86,Nested PCR:to increase specificity,First roundprimers,First roundPCR,Second roundprimers,Second roundPCR,Gene of interest,（三）模板,模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。,PCR模板制备与纯化,上述粗样品含有大量的PCR反应抑制物质，因此如何去除这些种类繁多的抑制剂或者添加必要的PCR反应增强剂显得十分重要。,PCR模板制备与纯化,从各种粗样品中去除PCR反应抑制剂的程序不尽相同，但常用的手段包括：,（四）脱氧三磷酸核苷酸（dNTPs）,(五）M
27、g2+Taq酶活性所必需，游离的,Mg2+的标准使用范围：0.5-10 mM,特异性的改进：降低Mg2+浓度，但要注意过低的Mg2+浓度又会影响扩增产物的产量。,有效性的改进：提高Mg2+浓度，但过量Mg2+将导致非特异性扩增,Mg2+的浓度影响扩增产物的特异性、引物退火、引物二聚体的形成、熔点温度、酶的活性和准确性。因此，PCR反应系统的主要优化参数是Mg2+的浓度。,(六）PCR的热循环计划,PCR反应条件的选择,PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤（DNA变性、引物退火和反应延伸）而设置变性-退火-延伸三个温度点。双链DNA在9095变性，再迅速冷
28、却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。,退火杂交温度和时间,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素,特异性的改进：提高退火温度（比建议退火温度提高2-5）；减少退火时间。过长的退火时间在正常情况下并不能提高产量，只会增加非特异性引物杂交的可能性。,退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有模板的长度。,Optimising the Annealing Temperature,Primers have a calculated annealing temperature(e.g.54C)Temperatu
29、re must be confirmed practicallyTemperature steps of 2C above and belowUse gradient cycler,循环次数,决定PCR扩增程度 主要取决于模板DNA的浓度 选在2540次之间,影响的主要因素包括,扩增底物（引物和dNTPs）有效浓度的下降,非特异性产物或引物二聚体对反应试剂的竞争作用,反应试剂的稳定性,扩增产物抑制作用,高浓度产物的退活作用以及不完全变性,第五节 PCR中应注意的事项,（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模
30、板,第六节 PCR技术类型,反向PCR 锚定PCR不对称PCR 原位PCRRT-PCR 重组PCR差异显示PCR 免疫PCR实时定量PCR 多重PCR,1)反向PCR(reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,2）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分
31、别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究,高浓度引物,低浓度引物,3）RTPCR:是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应,用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性,克隆mRNA的5和3末端序列,以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。,标准的RT-PCR程序包括：,mRNA的分离,cDNA反应的引物退火,mRNA反转录为cDNA,cDNA的PCR扩增,引物选择有三种战略：,基因特异性引物化，最精确灵敏,寡聚dT引物化,随机六
32、聚体引物化,RDDP（反转录酶）引物、4种dNTP,RNase（核酸酶H活性),DDDP（DNA聚合酶活性）4种dNTP,RNA-DNA 杂化分子,双链DNA（cDNA第二链）,反转录为cDNA,原位PCR（1990）,以组织固定处理细胞内的DNA 或RNA 为靶序列，进行PCR反应，不必分离模板DNA或RNA,探针原位杂交,蛋白酶 处理,多重PCR（Multi PCR）,加入多对引物，对同一模板的若干区域进行同时扩增。适用于绘制真核生物庞大基因或基因组中的缺失图谱，如分子病的临床辅助诊断。,P1,P2,P3,P4,P1,P2,P3,P4,正常人扩增物,病人扩增物,多对引物的组合必须满足二个条
33、件：将反应条件较为接近的引物组合在一起，以使反应条件尽量适合所有被扩增片段；同一反应内各扩增片段的大小应不同，以便检测时能通过电泳将各片段分离开。,锚定PCR（Anchored PCR）,AAAAA 3,3 GGGGGGGG,锚定引物,锚定PCR又称为 cDNA末端快速扩增PCR，主要用于5端序列未知的cDNA的扩增和克隆。,5,5,5 CCCCCCCC,5 CCCCCCCC,5,特异性引物,免疫PCR,免疫PCR：结合了PCR扩增体系和以免疫反应原理为基础的技术，对扩增产物进行特异鉴定和定量分析的反应。（一）寡核苷酸探针检测系统（二）RNA探针-抗体捕获系统,寡核苷酸探针检测系统,此种系统十
34、分灵敏，它能检测微板中约10pg的生物素化PCR产物，并且适合应用于任何靶序列。,RNA探针-抗体捕获系统,PCR-RFLP：根据突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点内而设计的对PCR产物作限制性片段长度多态性分析的技术。RFLP：在同种生物不同个体出现不同长度限制性片段类型的现象。,PCR-限制片段长度多态性,PCR mutagenesis(诱变),PCR can be used to introduce deletion and point mutations,Two separate PCR reactions are performed.One PCR amplifying the
35、5-portion of the insert,and the other amplifying the 3-portion of the insert.The point mutation/deletion mutations are located in the primers,SP6 primer,T7 primer,Forward mutagenic primer,Reverse mutagenic primer,First PCR,Remove primersDenature and anneal,Extend to full length by DNA polymerase,3,3
36、,Second PCR,SP6 primer,T7 primer,DNA cloning,第七节 PCR技术在临床医学方面的应用,PCR检测病原体,PCR临床诊断术,PCR检测病原体,临床上检测病原体通常有三类方法：,相比较而言，PCR检测法在很多情况下不需要培养。这不仅省时，更重要的是很多病原微生物难以培养，如某些病毒、真菌厌氧菌、支原体等；,PCR检测法比免疫分析法更廉价；,PCR检测法可以使用多重引物同时检测若干种病原微生物。PCR检测程序已自动化。,PCR临床诊断术,PCR临床疾病诊断术的主要原理有下列几个方面：,第八节 常规PCR的常见问题及处置措施,不出现扩增条带（假阴性）非特异性
37、扩增产物过多：产物呈拖尾现象或呈涂布状 引物二聚体的形成 所有样品均为阳性（假阳性）,PCR常见问题之一,无扩增产物,现象：正对照有条带，而样品则无,PCR常见问题之二,非特异性扩增,现象：1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致；2）或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,非特异性扩增,PCR常见问题之三,拖尾,现象：产物在凝胶上呈Smear状态,M 1 2,拖尾,PCR常见问题之四,假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况),原因：靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：空白对照出现目的扩增产物,假阳性,9.1 污染原因,(1)模板间交叉污染(2)PCR试剂污染(3)实验室中克隆质粒的污染,第九节 PCR污染,9.2 防止污染的方法,(1)合理分隔实验室(2)移液枪不能接触PCR相关试剂(3)手套、吸头、小离心管一次性使用(4)设阳性和阴性对照，重复实验,
