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1、（生物科技行业）食品微生物学实验技术食品微生物学实验技术实验1食品中细菌菌落总数的测定1目的要求（1）掌握食品中菌落总数测定方法。（2）了解食品清洁程度（被污染程度）及观察细菌在食品中繁殖的动态，从而为被检样品进行卫生学评价时提供依据。2基本原理菌落（colony）是指细菌在某一种固体培养基上克隆增殖发育成肉眼可见的细菌集团。菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1mL（g，cm2)检样中所含菌落总数。通常以cfu/g（mL，cm2)表示，cfu代表的colonyforningunit。菌落总数是作为判定食品的清洁程度（被污染程度
2、）的标记，通常越干净的食品，单位样品菌落总数越低。反之，菌落总数就越高。菌落总数的测定是以每个活细菌能克隆增殖形成一个可见的单独菌落为基础的，但是在实践中除了单个细胞形成菌落外，二个或两个以上相连的同种细胞也同样可形成菌落，所以现在均以菌落总数（而不是活细菌数）或菌落形成单位数表达。由于菌落总数的测定是在37有氧条件下培养的结果，对于厌氧菌、微需氧菌、嗜冷菌和嗜热菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的细菌也受到限制。因此，这种方法所得到的结果，实际上只包括一群在普通营养琼脂中发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。但由于在自然界这类细菌占大多数，其数量的多少能反映出样品中细菌的总数，正因为
3、如此，用该方法来测定食品中含有的细菌总数已得到了广泛的认可。3实验材料31仪器恒温箱、冰箱、恒温水浴锅、天平、微波炉、均质器。32材料吸管（容量为0.1mL、1m和10mL）、广口瓶或三角烧瓶、灭菌平皿、试管、酒精灯、试管架、灭菌剪刀、灭菌镊子。33试剂营养琼脂培养基、75%乙醇、0.85%生理盐水。4实验方法与步骤41菌落总数实验程序（如图28-1）42检样稀释及培养（1）以无菌操作将检样25g(25mL)剪碎放于装有225mL灭菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶内，经过充分振荡或均质处理制作成1：10的均匀稀释液（固体食品有的需先用灭菌研钵研磨后再稀释）。（2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1
4、mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管混合均匀，作成1：100稀释液，按上述操作顺序，作10倍系列稀释液，每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。（3）根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择23个适宜稀释液，分别在作10倍递增稀释同时，吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。（4）稀释液移入平皿后，应及时将融化并冷却到46营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿使其混合均匀，同时将营养琼脂培养基注入加有无菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照。（5）待琼脂凝固后，翻转平板，置36+1温箱内培养24+
5、2hr（肉、乳和蛋品为48+2h，水产为3048+2h）。48+2h36+1检样做成几个适当倍数的稀释液选择23个适宜稀释度，各以1ml量加入灭菌平皿内每皿内加入适量营养琼脂菌落计数结果图28-1 菌落总数实验程序43菌落计数将培养24h后的平板取出，选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准，一个稀释度使用两个平板，取两个平板的平均数，乘以稀释倍数，即得每克（或毫升）样品所含菌落总数。44平板菌落计数方法(1)平板菌落数的选择选取菌落数在30300个之间的平板作为菌落总数测定的标准，且一个稀释度应使用两个平板的平均数。其中当一个平板有较大片状菌落生长时，若片状菌落不到平板的一半，而
6、其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。(2)稀释度的选择A应选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。B若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300个之间，则视二者之比如何来决定，若其比值小于2，应报告其平均数；若两者之比大于2，则报告其中较小的数字。C若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。D若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最底的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。E若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。F若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于3
7、00或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。(3)菌落数的报告菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。(见表28-1)表28-1稀释度选择及菌落数报告方式例次,稀释液及菌落数,两稀释液之比,菌落总数（cfu/g，mL）,报告方式（cfu/g，mL）,10-1,10-2,10-3,1,多不可计,164,20,-,164000,16000或1.61042,多不可计,295,46,16,37750,38000或3.81043,多不可计,271,60,
8、22,27100,27000或2.71044,多不可计,多不可计,313,-,313000,310000或3.11055,27,11,5,-,270,270或2.71026,0,0,0,-,110,107,多不可计,305,12,-,30500,31000或3.11045实验结果（1）将实验得到的菌落总数结果记入下表,10-2,10-3,10-4,10-5,备注1,2,平均,（2）报告所选两个稀释度之比及检测结果。6注意事项（1）若实验样品为食品，为防止食品碎屑混入琼脂影响计数，通常需在琼脂中添加一定量TTC(氯化三苯四氮唑)，每100mL加1mL0.5%TTC，培养后，如系食品颗粒，不见变化
9、，如为细菌，则生成红色菌落。（2）理论上讲，为了得到实验食品中所有细菌菌落总数，应将样品接种到几种不同的培养基中并培养在不同的条件下，所得到的细菌菌落数总和。但根据国家颁发的不同食品的规定，都是根据用普通营养琼脂，37（水产品30）进行需氧培养的结果来确定的，而且这种测定确具代表性，因而菌落总数在一般卫生学评价中并不要求用不同培养基进行选择性培养。（3）目前还有几种快速检测菌落总数的方法如由军事医学科学院研制而成食品细菌检验箱，菌落总数测定采用试管斜面计数法操作简便，不易受污染，结果与国标法平板计数一致。另一种是3M有限公司提供的PetrifilmPlates测试片（菌落总数测试片）。由于测试
10、片中含有一种红色指示剂，使所有菌落易于识别计数，该片也可用于乳酸菌测定，48hr可确定菌落总数。7思考题（1）什么是菌落总数，何谓cfu？（2）若平板上菌落数生长一半较均匀，另一半呈片生长，如何计数菌落数？（3）影响杂菌总数准确性的因素有哪些？实验2食品中大肠菌群的测定1目的要求（1）学习与掌握食品中大肠菌群的测定方法。（2）了解大肠菌群在食品卫生学检验中的意义。2基本原理大肠菌群系指一群在3724hr能发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的埃希氏无芽孢杆菌。它包括大肠埃希氏杆菌和柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌等类大肠杆菌。大肠菌群的检测就是根据大肠菌群的定义，即利用它们能发酵乳糖产酸产气的特性而设计的初
11、发酵实验；初发酵阳性管通过伊红美兰平板进行分离；复发酵对分离菌作证实实验的三步法。根据证实为大肠菌群阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的最可能数（食品中大肠菌群系以每100mL（g）检样内大肠菌群最可能数MPN表示），MPN最可能数是表示样品中活菌密度的估计。3实验材料31仪器温箱、冰箱、恒温水浴、天平、微波炉、均质器、普通光学显微镜。32材料吸管（0.1mL、1mL和10mL）、广口瓶或三角烧瓶、玻璃珠、平皿、试管、酒精灯、试管架、灭菌剪刀、镊子、小倒管等。33培养基乳糖胆盐培养基，伊红美兰琼脂，乳糖发酵培养基，革兰氏染色液，0.85%生理盐水。4实验方法与步骤41大肠
12、菌群检验程序（如图29-1）42检样稀释取检样25g(mL)剪碎，以225mL灭菌生理盐水稀释做成1:10稀释液，并依次做10倍递增稀释液，例如10-1，10-2，10-3，10-4等，估计样品污染程度，选择3个合适稀释液备用。43乳糖发酵试验将待稀释检样品接种乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，每一稀释度接种3管，置36+1温箱内培养24+2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，可报告为大肠菌群阴性。如有产气者，则按下列程序进行。44分离培养用接种环挑取产气的乳糖胆盐发酵管划线接种在伊红美兰琼脂平板上，36+1温箱内1824h
13、培养，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。典型的大肠埃希氏菌落呈紫黑色金属光泽，非典型大肠菌群有时为红色菌落。45证实试验在上述平板上，挑取带有黑色金属光泽的可疑大肠菌群菌落12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管36+1培养24+2h后观察产气情况。凡乳糖管产气，革兰氏染色阴性的无芽孢杆菌即可报告为大肠菌群阳性。5实验结果（1）将大肠菌群检验结果填入下表接种量,管号,发酵反应结果,有无典型菌落,革兰氏染色结果,复发酵反应结果,最后结论+或-1mL,123,0.1mL,123,0.01mL,123,（2）根据证实为大肠菌群的阳性管数，查（MPN检索表后报告每100mL(g)大肠菌群的最可能
14、数。6注意事项双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。30mL和10mL乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用，3mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。（1）初发酵实验与证实实验有时不一定符合。凡初发酵的产气管一定要做伊红美兰平板分离。如果平板出现典型的大肠菌菌落，G-染色阴性无芽孢菌，即可做出判定。如果平板上典型菌落少，应多挑取菌落包括挑菌落中心黑红、灰红，以及红、粉红等菌落，在革兰氏染色的同时，做证实试验，以免出现假阴性。（2）关于产气发酵管内的小倒管如储留气体则是阳性结果，如果不存留气体，但液面及管壁可以看到缓慢上浮的小气泡，或者对没有气体产生的发酵管用手轻轻弹动试管，有气泡出现而且沿管壁上升，都
15、应考虑可能是由菌发酵产生气体的缘故。应做进一步观察，因为这种情况阳性检出率可达50%以上。（3）所谓典型大肠埃希氏菌是指具有该菌所有生物学特性的大肠菌。新近随粪便排出的大肠菌多属于这一类型。所以如查出多量典型大肠埃希氏菌表明样品是粪便的近期污染结果。研究表明，典型大肠菌随粪便排到外界环境中约一周后，典型菌可变为非典型菌。这种变化以生化变异为主。如果样品检测以非典型大肠菌为主，则指示样品受粪便的远期污染。大肠埃希氏菌大量存在于人畜肠道，并随粪便排出。本菌在粪便中数量多，易于培养，对外界的抵抗力与肠道致病菌比较相近，所以选择大肠埃希氏菌作为被粪便污染的指示菌，合理、科学。凡被粪便污染的样品，就有可
16、能受到致病菌污染。所以大肠菌群的测定是必做的食品卫生学检项目。（4）大肠菌群检验方法（国标）采用的管发酵通常需三天，目前已开发出几种快速检验方法（TTC显色法，DC试管法，纸片法）。如由军事医学科学研究院研制而成的一小时快速检测法，检验结果与国标法一致。3M中国有限公司提供的petrifilmplates测试片，可在小时确定大肠菌群数。7思考题（1）什么是大肠菌群？大肠菌群表示的单位及其意义。（2）固体检样三个稀释度检测结果都是阴性时，MPN怎样表示？（3）液体检样三个稀释度检测结果都是阴性时，MPN怎样表示？（4）大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管发酵？实验3食品中金黄色葡萄球菌的检
17、测1目的要求（1）了解食品和食物中毒样品中金黄色葡萄球菌的检测方法。（2）观察金黄色葡萄球菌的革兰氏染色镜检形态以及在血平板和Baird-Parker氏琼脂平板上生长的菌落特征。（3）观察金黄色葡萄球菌产生血浆凝固酶现象。2基本原理金黄色葡萄球菌可产生多种毒素和酶。在血平板上生长时，因产生金黄色色素使菌落呈金黄色；由于产生溶血素使菌落周围形成大而透明的溶血圈。在Baird-Parker氏平板上生长时，因将亚碲酸钾还原成碲酸钾使菌落呈灰黑色；因产生脂酶使菌落周围有一浑浊带，而在其外层因产生蛋白水解酶有一透明带。在肉汤中生长时，菌体可生成血浆凝固酶并释放于培养基中（叫做游离凝固酶）。此酶类似凝血酶
18、原物质，不直接作用到血浆纤维蛋白原上，而是被血浆中的致活剂（即凝固酶致活因子）激活后，变成耐热的凝血酶样物质，此物质可使血浆中的液态纤维蛋白原变成固态纤维蛋白，血浆因而成凝固状态。3实验材料31仪器和材料显微镜、温箱、离心机、灭菌吸管（1mL，10mL）、灭菌试管、灭菌平皿、均质器、载玻片、L型涂布棒、酒精灯、接种环。32培养基及试剂胰酪胨大豆肉汤、7.5%氯化钠肉汤、豆粉琼脂、血琼脂平板、Baird-Parker琼脂平板、肉浸液肉汤、兔血浆、革兰氏染色液等。4实验方法与步骤41金黄色葡萄球菌检测程序（如图30-1）24h36+124h36+124h36+124h36+1检样25g(ml)+2
19、25ml灭菌生理盐水直接记数方法增菌培养方法Baird-Parker平板0.3ml、0.3ml、0.4ml7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤血 平 板血平板，Baird-Parker平板涂片染色观察溶血血浆凝固酶实验报 告图30-1 金黄色葡萄球菌检测程序42增菌培养法（1）检样处理称取25g固体样品或吸取25mL液体样品，加入225mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。（2）增菌及分离培养吸取5mL上述混悬液，接种于50mL7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤培养基内，置361温箱培养24h，转种于血平板和BairdParker平板上，361培养24h，挑取可疑金黄色葡萄球菌菌
20、落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。（3）形态金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽孢，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.51m。（4）培养特征在肉汤中呈混浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在BairdParker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所
21、产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。（5）血浆凝固酶试验吸取14新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放361温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。43直接计数法（1）吸取上述1：10混悬液，进行10倍系列稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL，分别加入到三块BairdParker平板中，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分不多吸收，可将平板放在361
22、温箱1h，等水分蒸发后反转平皿置361温箱培养。（2）在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选5个菌落，分别接种血平板，36124h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。（3）将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌的黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。5实验结果（1）金黄色葡萄球菌涂片染色镜检为阳性球菌，致病性葡萄球菌一般较非致病性葡萄球菌小，且各个菌体的大小排列也较整齐。细菌繁殖时呈多个平面的不规则分裂，堆积成葡萄串状。在中毒食品、脓汁或液体培养基中常呈单个或环球短链排列，易误认为链球菌或细球菌。（2）金黄色葡萄
23、球菌在血平板上菌落呈金黄色，周围有溶血圈，在Baird-Parker平板上菌落呈灰黑色，周围为一浑浊带，在其外层有一透明圈。（3）致病性葡萄球菌血浆凝固酶为阳性。6注意事项（1）在做样品中金黄色葡萄球菌计数进行10倍递次稀释时，要注意每个稀释度更换吸管。（2）实验中操作者须注意生物安全防护，实验结束后要消毒环境，把实验材料高压灭菌后方可清洗或弃之。7思考题（1）金黄色葡萄球菌引起食物中毒的机理是什么？（2）为什么采用血浆凝固酶试验来决定葡萄球菌致病和不致病?实验4食品中溶血性链球菌的检测1目的要求（1）了解食品和食物中毒样品中溶血性链球菌的检测方法。（2）观察溶血性链球菌的革兰氏染色镜检形态以
24、及在血平板上菌落特征及溶血情况。（3）观察乙型溶血性链球菌产生链激酶的现象以及杆菌肽敏感实验结果。2基本原理乙型（）溶血性链球菌致病性强，能产生溶血毒素，在血平板上生长，可使菌落周围形成一个有24mm宽，界限分明，完全透明的无色溶血环，称乙型溶血；还能产生链激酶（又称溶纤维蛋白酶），激活血浆中的血浆蛋白酶原，使之变成活动性的血浆蛋白酶，故可溶解血块或阻止血浆凝固；还可以产生胞外cAMP因子，它可以增强葡萄球菌的溶血能力，即增强对羊、牛血红细胞的溶解能力。因此，在羊血琼脂平板上接种链球菌处，可以见到蘑菇状或箭头样的溶血区。3实验材料31设备和材料温箱、水浴、显微镜、离心机、试管架、灭菌平皿、灭菌
25、小试管、载玻片、灭菌吸管（1mL、10mL）灭菌镊子、均质器、酒精灯、接种环。32培养基和试剂葡萄糖肉浸液肉汤、牛心浸液、匹克氏肉汤、血琼脂平板、人血浆、0.25%氯化钙、灭菌生理盐水、杆菌肽药敏纸片(含0.04单位)。4实验方法与步骤：41溶血性链球菌检验程序（如图31-1）42样品处理称取25g固体检样或称取25mL液体检样，加入225mL灭菌生理盐水制成混悬液。43一般培养将上述混悬液吸取5mL，接种于50mL葡萄糖肉浸液肉汤或直接划线接种于血平板，如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经361培养24h后接种血平板，置361培养24h，挑取乙型溶血圆形突起的细小菌落在血平板上分
26、纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。44形态与染色本菌呈球形或卵圆形，直径0.51m，链状排列，链长短不一，短者48个细胞组成，长者2030个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链，不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。45培养特性该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时，管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑有乳光，直径约0.50.75m，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有24mm界限分明、无色透明的溶血圈。46链激酶试
27、验致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶)，此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原成为血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。吸取草酸钾血浆0.2mL，加0.8mL灭菌生理盐水混匀，再加入1824h361培养的链球菌培养物0.5mL及0.25%氯化钙0.25mL(如氯化钙已潮解，可适当加大至0.3%0.35%)，振荡摇匀，置于361水浴中10min，血浆混合物自行凝固(凝固程度至试管倒置，内容物不流动)。然后观察凝固块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性。若24h后不溶解即为阴性。草酸钾人血浆配制：草酸钾0.01g放入灭菌小试管中，再加入5mL人血混匀，经离心沉淀吸取上清液即为草酸钾人血浆。4
28、7杆菌肽敏感试验挑取乙型溶血性链球菌液涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片放于上述平板上，置于361下培养1824h，如有抑菌带出现即为阳性。同时用已知阳性菌株作为对照。5实验结果（1）溶血性链球菌涂片染色镜检为革兰氏阳性，呈球形或卵原形直径为0.51微米，链状排列，链的长短不一，短者由48个菌体组成，长者达2030个菌。液体培养基中易呈长链，固体培养基中常呈短链。（2）溶血性链球菌在血平板上形成的菌落为灰白色，半透明，表面光滑有乳光，直径约为0.50.75mm的圆形突起的细小菌落。乙型溶血性链球菌菌落周围呈完全溶血，并有明显的溶血境界。在显微镜低倍镜下观察，菌落周围
29、一般不能见到红血球。乙类溶血性链球菌在血平板上对杆菌胎敏感，经37培养18小时，出现明显抑菌圈。6注意事项（1）做链激酶实验时注意人血浆应新鲜。（2）实验中操作者须注意生物安全防护，实验结束后要消毒环境，把实验材料高压灭菌后方可清洗或弃之。7思考题（1）溶血性链球菌在血平板上生长时的菌落特征？（2）溶血性链球菌的致病力强弱与那些生物特性有关？实验5食品中沙门氏菌属的检验1目的要求（1）学习食品中沙门氏菌属的检验方法和基本原理。（2）熟悉沙门氏菌属因子血清的使用方法。（3）了解沙门氏菌属的生化反应及基本原理。2基本原理沙门氏菌属是肠道杆菌科中最重要的病原菌属，它是引起人类和动物发病及食物中毒的主
30、要病原菌之一。食品中沙门氏菌的含量较少，且常由于食品加工过程使其受到损伤而处于濒死的状态。为了分离与检测食品中的沙门氏菌，对某些加工食品必须经过前增菌处理，用无选择性的培养基使处于频死状态的沙门氏菌恢复其活力，再进行选择性增菌，使沙门氏菌得以增殖而大多数的其它细菌受到抑制，然后再进行分离鉴定。沙门氏菌属是一群血清学上相关的需氧，无芽孢的革兰氏阴性杆菌，周身鞭毛，能运动，不发酵侧金盏花醇、乳糖及蔗糖，不液化明胶，不产生靛基质，不分解尿素，能有规律地发酵葡萄糖并产生气体。沙门氏菌属细菌由于不发酵乳糖，能在各种选择性培养基上生成特殊形态的菌落。大肠杆菌由于发酵乳糖产酸而出现与沙门氏菌形态特征不同的菌
31、落，如在SS琼脂平板上使中性红指示剂变红，菌落呈红色，借此可把沙门氏菌同大肠杆菌相区别。根据沙门氏菌属的生化特征，借助于三糖铁、靛基质，尿素、KCN，赖氨酸等试验可与肠道其它菌属相鉴别。本菌属的所有菌种均有特殊的抗原结构，借此也可以把它们分辨出来。3实验材料31设备和材料天平、均质器或研钵、培养箱、显微镜、灭菌广口瓶、灭菌三角烧瓶、灭菌吸管（l0mL）、灭菌平皿、灭菌小玻管、灭菌毛细吸管、橡皮乳头、载玻片、酒精灯、灭菌金属匙或玻璃棒、接种棒、试管架等。32培养基和试剂缓冲蛋白胨水(BP)，氯化镁孔雀绿(MM)增菌液，四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液，亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液，亚硫酸铋琼脂(B
32、S)，DHL琼脂，HE琼脂，SS琼脂，三铁糖琼脂(TSI)，蛋白胨水，靛基质试剂，pH7.2尿素琼脂，KCN培养基，氨基酸脱羧酶试验培养基，糖发酵管，ONPG培养基，半固体琼脂，缓冲葡萄糖蛋白胨水(附MR、VP试剂)，丙二酸钠培养基，氧化酶试剂，革兰氏染色液，26种(初步分型)、57种(一般分型)、144种(详细分型)沙门氏菌因子血清。4实验方法与步骤41沙门氏菌属检验程序（如图32-1）42前增菌和增菌冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品均应经过前增菌。各称取样品25g，加在装有225mL缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内，固体食品可用均质器，800010000rpm/min打碎lmin，或用研钵加
33、灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化。于361培养4h(干蛋品需培养1824h)，移取10mL转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42培养1824h。同时另取10mL，加入于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36l培养1824h。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其它未经加工的食品不必经过前增菌。各取25mL加入灭菌生理盐水225mL，按前法做成检样匀液，取其半量接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内于42培养24h，另半量接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36l，培养1824h。43分离取增菌液一环，划线接种于BS平板一个和DHL琼脂平板(或HE
34、琼脂平板、或SS琼脂平板)一个。于361分别培养1824h(DHL、HE，SS)或4048h(BS)。观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌亚属I、，、V和亚属在各个平板上的菌落特征见表321。一般4h，干蛋品1824h361824h4048h361824h1824h3611824h3611824h424236检 样前增菌法：冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品 25gBP 225ml直接增菌法：鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品25g灭菌生理盐水225ml，做成检液匀液10mlMM(或TTB)100ml10ml+SC100ml;检样匀液25ml+MM（或TTB）100mlBSDHL(或HE、WS、S
35、S)挑取可疑菌落TSI（斜面、底面、产气、H2S），蛋白胨水（靛基质），尿素（pH7.2），KCN，赖氨酸H2S+，靛基质 尿素，KCN赖氨酸H2S+，靛基质 尿素，KCN赖氨酸H2S，靛基质 尿素，KCN赖氨酸/非如左述的各种反应结果甘露醇、山梨醇沙门氏菌血清学试验ONPG非沙门氏菌沙门氏菌血清学试验非沙门氏菌报 告检样匀25mlSC100ml（或TTB）100ml图32-1 沙门氏菌属检验程序表32-1沙门氏菌属各亚属在各种选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板,亚属、,亚属（即亚利桑那菌）亚硫酸琼脂,产H2S菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色、菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产
36、生H2S，形成灰绿色的菌落，周围培养基不变色。,黑色有金属光泽。DHL琼脂,无色半透明，产生H2S菌落中心带黑色或几乎全黑色。,乳糖迟缓阳性或阴性的菌株，与亚属、相同，乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色。HE琼脂,蓝绿色或蓝色，多数菌株产H2S，菌落中心黑色或几乎全黑色。,乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色；乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色，中心黑色或几乎全黑色。SS琼脂,无色透明，产生H2S菌株，有的菌落中心带黑色，但不如以上培养基明显。,乳糖迟缓阳性或阴性的菌株，与亚属、相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心黑色，但中心无黑色形成时与大肠埃希氏菌不能区别。44三糖铁高层琼脂初步鉴
37、别挑选上述选择性琼脂平板上的可疑菌落，接种到三糖铁琼脂斜面试管中，于361分别培养1824h，然后根据表32-2初步判断是否为可疑沙门氏菌。表32-2肠杆菌科各菌属在三糖铁琼脂内的反应结果斜面,底层,产气,H2S,可能的菌属,/,沙门氏菌属、变形杆菌属、枸橼酸杆菌属、爱德华氏菌属,/,沙门氏菌属亚属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属,沙门氏菌属、埃希氏菌属、哈夫尼亚菌属、摩根氏菌属、普罗菲登斯菌属,伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、埃希氏菌属、哈夫尼亚菌属、摩根氏菌属、普罗菲登斯菌属,/,埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、枸橼酸杆菌属该表说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时H2S阴性
38、的菌株可以排除，其它的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能。因此需要做几项最低限度的实验。45生化试验在接种三糖铁的同时，再接种蛋白胨水(供作靛基质试验)、尿素（pH7.2）琼脂、KCN培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于36l培养18-24h，必要时可延长至48小时，按表32-3判断结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其它五种结果均可排除。表32-3肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表反应序号,H2S,靛基质,pH7.2尿素,KCN,赖氨酸脱羧酶,判定菌属A1,沙门氏菌属A2,沙门氏菌属（少见）、爱德华氏菌属A3,枸橼酸杆菌属、奇异变形
39、杆菌A4,普通变形杆菌B1,沙门氏菌属、埃希氏菌属甲型副伤寒沙门氏菌、埃希氏菌属、志贺氏菌属B2,埃希氏菌属埃希氏菌属、志贺氏菌属B3,/,克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、枸橼酸杆菌属B4,/,摩根氏菌属、普罗菲登斯菌属注：（1）三糖铁琼脂底层均应产酸，不产酸者可排除。斜面产酸与产气与否均不限。（2）KCN和赖氨酸可选用其中一项，但不能判定结果，仍需补做另一项。（3）阳性、阴性、/多数阳性、少数阴性。（1）反应序号A1典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸三项中有一项异常、按表323附1仍可判定为沙门氏菌。如有两项异常，则按A3，判定为枸橼酸杆菌。表32-3-A附1pH7.2尿素,KCN
40、,赖氨酸,判定结果,甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）,沙门氏菌或（要求符合本群生化特性）,沙门氏菌个别变种（要求血清学鉴定结果）（2）反应序号A2可先做血清学鉴定，当AF多价血清不凝集时，补作甘露醇和山梨醇，按表323附2判定结果。表32-3附2甘露醇,山梨醇,判定结果,沙门氏菌属靛基质阳性变种（要求血清学鉴定结果）,缓慢爱德华氏菌（3）反应序号B1三糖铁斜面产酸的菌株可首先排除，不产酸者可先做血清学鉴定，当AF多价血清不凝集时，补做鸟氨酸、ONPG、水杨苷、棉子糖和半固体动力试验，按实验表323附3判定结果。必要时按表324，进行沙门氏菌属亚属或其它亚属的鉴定.表32-3附3赖氨酸,
41、乌氨酸,ONPG,水杨苷,棉子糖,动力,判定结果,沙门氏菌属,志贺氏菌属,宋内氏志贺氏菌属d,d,d,d,d,埃希氏菌属注：判定结果时应注意伤寒沙门氏菌鸟氨酸阴性，甲型副伤寒沙门氏菌赖氯酸阴性，鸡沙门氏菌无动力。表中d表示有不同反应结果。如果未做KCN试验时，常需做V-P试验（22250C，4天），哈夫尼亚菌属为阳性。表32-4沙门氏菌属亚属的鉴定项目,亚属,乳糖,/（）,ONPG,卫矛醇,丙二酸钠,KCN,水杨苷,（）迟缓阳性46血清学分型鉴定（1）抗原的准备一般采用1.5琼脂斜面培养物作玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的(如253)培养基上再检查，如果是由于Vi
42、抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于lmL生理盐水中作成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.70.8半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长后，在其边缘部分取菌检查，或将菌株通过装有0.30.4半固体琼脂的小玻管12次，自远端取菌培养后再检查。（2）抗原的鉴定用AF多价O血清作玻片凝集试验，同时用生理盐水作对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株，不能分型。被AF多价O血清凝集者，依次用O4、O3、O10、O7、O8、O9、O2、和O11因子血清作凝集试验，根据试验结果判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清作凝集试
43、验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成份的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。不被AF多价O血清凝集者，先用57种或144种沙门氏菌因子血清中的7种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下：OAl，2，3，4，5，9，10，12，19，2l，26,46OB6，7，8，11，13，14,20，22，23，24OC16，17，18，28，30，35，38OD39，40，41，42，43，44，45OE47，48，50，51，52OF53，54，55，5
44、6，57，58，59OG60，61，62，63，65,66，67（3）H抗原的鉴定属于AF各O群的常见菌型，依次用下述(表32一5)H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。不常见的菌型，先用144种沙门氏菌因子血清中的6种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查以确定第1相或第2相的H抗原。每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的，可在琼脂斜面上移种12代后再检查。如仍只检出一个相应的抗原，要用位相变异的方法检验其另一个相。单菌相不必作
45、位相变异检查。表32-5AF群见菌型H抗原表O群,第1相,第2相A,a,无,g,f,s,无,i,b,d,2C1,k,v,r,c,5Z15C2,b,d,r,2，5D(不产气的),d,无D(不气的),gmpq,无E1,hv,6，w，xE2,h,6wE4,gst,无E4,i,Z6F,i,2HAa，b，c，d，i，Z10，Z29HBe，h；e，n，x；f，g；g，m，s；g，p；m，tHCk，l，v；r，y，Z，Z4，Z23HD1，2；l，5；1，6；1，7；Z6HEZ35，Z36，Z38，Z39，Z41，Z42，Z44HFZ52，Z53，Z54，Z55，Z56，Z57（4）V1抗原的鉴定用V1因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌。5实验结果综合以上生化实验和血清学分型鉴定的结
