《基因工程的基本原理学案》.doc

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1、基因工程的基本原理学案 作者： 日期：基因工程的基本原理学案张建尚/江苏【学习目标】站得高明确学习目标。1.简述DNA重组技术所需的三种基本工具。2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。3.简述基因工程原理及基本操作程序。4.尝试设计某一转基因生物的研制过程。【重点和难点】重点：1.DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。2.基因工程基本操作程序的四个步骤。难点：1.基因工程载体需要具备的条件。2.从基因文库中获取目的基因和利用PCR技术扩增目的基因。【学法提示】1.联系DNA分子的结构，理解限制酶、DNA连接酶和载体的作用及特点，准确画出限制酶切割产生的末端；通过比较掌握DNA

2、连接酶和DNA聚合酶的作用特点。2.联系DNA复制、基因表达过程，理解PCR过程、基因表达载体的构建和目的基因的检测与鉴定。【课前预习】起步稳知识源于生活。1.基因工程中使用的“分子手术刀”是 ，它能够识别 的某种 ，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断开，从而使DNA DNA片段产 末端或 末端；基因工程中使用的“分子缝合针”是 ，其作用是将 “缝合”起来，恢复被限制酶切开了的 ；基因进入受体细胞的载体被称为“ ”，常用的载体有 等。2.作为载体DNA必须具备的特点有：具有一个至多个 ，供外源DNA片段插入其中；携带外源DNA进入受体细胞后，停留在细胞中进行 ，或者整合到染色体DN

3、A上，随染色体DNA进行 。具有特殊的 ，供重组DNA的 ；载体DNA必须是安全的。3.基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤： 、 和 。4.获取目的基因的方法有以下几种： 、 、 。基因表达载体的构建是基因工程的 ，一个基因表达载体的组成除了 外，还必须有 、 以及 等。其中 是RNA聚合酶识别和结合的部位。5.将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是 ， 是转基因动物中采用最多，也是最为有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法。转化大肠杆菌细胞时要先用 处理细胞，使其成为 细胞。用 方法可以检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，用 方法可以检测目的基因是否转录出了mRNA，用 方

4、法可以检测目的基因是否翻译成蛋白质。除了上述分子检测外，有的还需要进行 的鉴定。答案1. 限制性核酸内切酶（限制酶）双链DNA特定核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端平DNA连接酶双链DNA片段磷酸二酯键分子运输车质粒、噬菌体的衍生物和动植物病毒2. 限制酶切割位点自我复制同步复制遗传标记基因鉴定和选择3.目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定4.从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成核心目的基因启动子终止子标记基因启动子5. 农杆菌转化法显微注射法Ca2+感受态细胞DNA分子杂交分子杂交技术抗原-抗体杂交个体生物学

5、水平 【课堂探究】走得欢探索成长快乐。一、DNA重组技术的基本工具1.分析回答下列问题：（1）从噬菌体侵染细菌的实验来看，细菌等原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但这类原核生物没有绝灭，其保护机制是 。GGATCC CCTAGG （2）限制酶不能任意切割DNA分子的原因是 。 （3）已知限制性内切酶的识别序列和切点是-GGATCC-，请画出该酶切割 所产生的黏性末端。2.比较：DNA连接酶DNA聚合酶作用对象连接 DNA连接 DNA作用部位将DNA双链上 个缺口连接起来将 个核苷酸加到已存在的核酸片段上模板 共同点 3.思考并回答问题：（1）为什么不能把单独的DNA片段直接导入受体细胞？

6、 。如果选择的载体没有限制酶切割位点，能否制作出重组DNA？ 。（2）能否选用从霍乱弧菌中分离出来的质粒做载体？ 。（3）我们用肉眼不能直接观察到载体进入受体细胞，那如何鉴定呢？ 。生物材料DNA a一定大小范围DNA PCRcDNA 基因文库 基因组文库 c 人工合成获取目的基因d导入受体细胞得到转基因生物eb限制酶切割包括二、基因工程的基本操作程序完成基因工程的基本操作流程图，并回答问题：（1）填写图中ae的内容。复制原点1抗生素基因2（2）PCR过程中利用 使DNA解链为单链，所用DNA聚合酶的特点是 ，需要的引物有 种。（3）右图是基因表达载体模式图，图中1是 ，作用是 ，2是 ，作用

7、是 。抗生素基因的作用是 ，目的基因应该插入在 之间。（4）如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的 中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的 上。受体细胞若是体细胞则可以通过 技术获得个体，而动物基因工程的受体细胞通常是 。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用 处理大肠杆菌，以利于表达载体进入。（5）用 方法可以检测目的基因是否整合到染色体DNA上，为了检测目的基因是否转录出了mRNA，可用标记的目的基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为 ，为了检测目的基因转录的mRNA是否翻译成 ，常用抗原-抗体杂交技术。检测抗虫基

8、因是否导入棉花体内，简便方法是 。G GATCCCCTAG G答案一、1.（1）细菌细胞内的限制酶能切割侵入的噬菌体DNA，使之失去遗传作用（2） 限制酶具有特异性，能够识别特定核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子（3）2.双链单链两单不需要模板以一条DNA链为模板都能形成磷酸二酯键3.（1）直接导入的DNA片段不能复制，也容易被受体细胞水解不能（2）不能（3）利用载体上特殊的遗传标记基因进行鉴定和选择基因工程的基本原理基本工具基本操作程序DNA分子杂交RNA-DNA分子杂交抗原-抗体杂交目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定从基因文库中获取PCR扩增

9、化学方法人工合成目的构成导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞限制性核酸内切酶DNA连接酶载体分子水平个体水平农杆菌转化法显微注射法Ca2+处理二、（1）mRNA反转录cDNA文库构建表达载体目的基因的检测与鉴定（2）高温耐高温2（3）启动子是RNA聚合酶识别和转录的部位，驱动基因转录出mRNA终止子终止基因转录为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来启动子与终止子（4）T-DNA染色体的DNA植物组织培养受精卵Ca2+（5）DNA分子杂交分子杂交技术蛋白质用棉花叶直接饲喂害虫【知识体系】【课堂巩固】跑得快善于学习，手不释卷！ C T G C A G G A C G

10、 T Caabb5533为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处（填“a”或“b”）。构建重组DNA分子的载体一般选用病毒或 ，后者的形状成 。构建重组DNA分子时应将目的基因插入到载体上的 和 之间。（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 做探针进行分子杂交检测，又要用

11、 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。GGATCCGATC CCTAGGCTAG 用酶I和酶切割（5）已知限制性内切酶的识别序列和切点是-GGATCC-，限制性内切酶的识别序列和切点是-GATC-。在目的基因的左侧有酶的一个切点，右侧各有酶的一个切点（如下图所示）。请画出目的基因两侧被限制酶和限制酶同时切割后所形成的黏性末端。GGATCCGATC G GATCC GATCCCTAGGCTAG CCTAG GCTAG 用酶I和酶切割目的基因答案（1）a ；a ；质粒；小型环状；启动子；终止子（2）基因枪法（花粉管通道法）（3）植物组织培养（4）耐盐基因（目的基因；一定浓度的盐水浇灌（移植到盐碱地

12、中）（5）【课后作业】步步高巩固成果，对答如流！（2008海南）右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR 为四环素抗性基因，P启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。据图回答：ToriampRtctRPEcoRIBamHI（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有 、 、 三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行 。（2）

13、用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 ；若接种到含青霉素培养基中，能生长的原核宿主细胞所含的连接产物是 。（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是，其合成的产物是 。（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是 。答案（1）目的基因载体连接物；载体-载体连接物；目的基因-目的基因连接物；分离纯化（2）载体-载体连接物；目的基因-载体连接物、载体-载体连接物（3）启动子；mRNA（4）EcoRI和BamHI解析（1）目的基因

14、的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切后产生的黏性末端相同，此时在DNA连接酶的作用下会产生自身环化或形成串联寡聚物，由于题中求 的是“两个DNA片段之间连接形成的产物”，可排除自身环化这一情况，得到目的基因与目的基因、目的基因与质粒表达载体、质粒表达载体与质粒表达载体三种连接物。（2）由于质粒上的抗四环素基因被EcoRI切断失去作用，所以目的基因载体连接物和目的基因-目的基因连接物也就失去抗四环素的作用，只有载体载体连接物修复了抗四环素基因，使受体细胞（原核宿主细胞）能够在含四环素的培养基上正常生长。EcoRI没有破坏抗青霉素基因，所以导入基因载体连接物和载体载体连接物的原核宿主细胞能够

15、在含有青霉素的培养基上正常生长。（3）如果用EcoRI、BamHI两种限制酶同时处理目的基因的DNA和质粒表达载体，分离出的目的基因和质粒表达载体各自具有两个不同的黏性末端，而对于目的基因和质粒表达载体来说两者的黏性末端是一致的，在DNA连接酶作用下它们相互联结,使相匹配的切点相互补,而不至于发生自身环化产生定向重组体。（4）如果用EcoRI、BamHI两种限制酶同时处理目的基因的DNA和质粒表达载体，分离出的目的基因和质粒表达载体各自具有两个不同的黏性末端，而对于目的基因和质粒表达载体来说两者的黏性末端是一致的，在DNA连接酶作用下它们相互联结,使相匹配的切点相互补,而不至于发生自身环化产生定向重组体。