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1、第十三章 核素示踪在物质代谢研究中的应用示踪的放射性原子可以与被示踪的原子一样能够在机体内运行、分布并参与机体的各种转化、代谢过程。如果人们能够了解示踪剂在机体内经历的复杂过程，便能解释、预示机体内该物质的生理、生化代谢规律。所以，放射性核素示踪技术也就成为研究物质（包括药物，以下均统称物质）代谢的重要手段。第一节 核素示踪用于物质吸收的研究研究物质吸收的主要目的是了解物质吸收量（或吸收率）、吸收时的化学形态及吸收的解剖部位。吸收速率则常在示踪动力学中加以研究。一、物质吸收百分率的示踪研究不同的物质吸收率不同，并易受生理、病理及环境等因素变化的影响。实验中常研究影响吸收的物质方面（物质的性质、
2、溶解度等）和机体方面的因素，以阐明吸收率的变化。为更确切地反映机体吸收率的变化，通常都采用整体示踪技术。在一次给予示踪剂后测量其相对吸收率或吸收百分率。一般实验中常以消化道吸收率的研究为代表。但研究方法常因研究对象和研究目的不同而异。（一）整体计数法测定吸收量 此类方法适用于某种在机体内更新速度缓慢的物质，用发射射线的核素标记物作为示踪剂，经口服或灌胃引入体内，待粪便中基本上无放射性时，方可用计数器从体表测量机体内残存的放射性含量，除以投入的放射性总量，即得吸收率。小动物的整体测量可用普通的计数器。若被研究的示踪剂为非挥发性的，也可用灰化法制备样品，测定其残留灰中的放射性。而大动物和人的整体测
3、量，则需要全身测量装置。如已知维生素B12在人体更新慢（T121年），一次口服58Co标记的维生素B12后的710 d，受试者体内放射性达到坪值，测其放射性活度，并除以投入放射性活度，便求出吸收率。正常人的吸收率为4580；恶性贫血患者则为017。本方法不需进行样品处理，投入的示踪剂量小（3.7 kBq人-1次-1），但由于需要全身测量装置，使本方法的应用受到一定限制。（二）测量未被吸收残留量一次经口服或给实验动物灌胃一定量（摄入量）的、能被肠道吸收的示踪剂，在一定的时间内收集动物的粪便，测定其在粪便中的残留量。根据未被吸收的残留量，按公式（13.1）再计算示踪剂的吸收百分率。 （13.1）此
4、公式适用于那些经吸收后再被消化道排出的量可以忽略不计的示踪剂。如甘油三酯，正常人口服125I-甘油三酯，72 h粪便中残余放射性的百分率为25；吸收率则为9598。本法是由未被吸收的残留量计算吸收率的，而未被吸收的放射性残留量又受胃肠道的功能状态和全身性疾病的影响。此外，常因粪便收集不全，样品分离提纯不彻底，实验也会出现误差。所以，实验中应予以注意。（三）尿排出量的测定这是一种根据吸收后由尿排出的数量推算吸收率的方法。如已知某物质经肾排出，一次口服示踪剂后，在一定时间内测定由尿排出示踪剂的总量，可以反映吸收率。这种方法常受欲测物在体内的代谢、积聚及肾功能的影响，应用范围受限制。另外，对那些也能
5、由肾以外其他途经排出的物质，本法推算偏低，必须进行校正，即同时测定非经口给示踪剂后尿中的排出量，计算相对吸收率。或用口服不同核素标记物进行校正。例如VitB12缺乏与大红细胞性贫血的发病有关。在体内VitB12只有与胃粘膜细胞分泌的内因子相结合，方能被吸收。正常情况下，VitB12从尿中排出的量甚微（00.25 g/d）。病理条件下VitB12的吸收和排泄都发生改变，临床上常测定尿中VitB12的量作为诊断指标。为准确起见，如同时一次口服57Co-VitB12和58Co-VitB12，用双标记法测定24 h尿中57Co-B12和58Co-B12的排出量，对吸收率进行校正。（四）测定血浆中示踪剂
6、含量胃肠道给予的示踪剂，经消化作用后可被吸收进入血液。所以，测量血液中示踪剂的含量，可以直接了解示踪剂的吸收情况。可是，口服示踪剂后血浆中的浓度是边吸收边清除的结果，与一次静脉注射后的情况不同，静脉注射后则100地进入血液，其浓度随时间而下降，下降的速度主要取决于清除（进入组织、代谢、排泄等）速率。而口服示踪剂时，血液中浓度下降，同时取决于吸收率和清除率。为反映吸收率便提出了测定血浆中示踪物浓度时相曲线下的面积（area under curve，AUC），即是指血浆中示踪剂浓度对时间作图，所得的曲线下的面积。该面积可由积分求得。梯形规则法则是最简便的计算方法。为准确地反映示踪物在血浆中的浓度，
7、实验中常对比研究静脉注射和口服剂量相同的同种示踪剂的吸收率。当血浆清除图13-1 血浆示踪剂放射性浓度-时相曲线和曲线下面积(AUC)a:口服与静脉注射相比较（绝对生物利用度） b:两种口服方案或剂型相比较（相对生物利用度）速率常数和分布容积相同时，口服后的AUC或等于或小于静脉注射后的AUC。口服的AUC除以静脉注射的AUC，所得到的百分率，即绝对生物利用度（absolute bioavailability），是吸收率的估计值。口服两种不同剂型的示踪剂后，所得到的两个AUC的比值，则称为相对生物利用度（relative bioavailability）。 它能反映两种剂型示踪剂吸收率的相对大
8、小（图13.1）。为排除血浆清除率对实验结果的影响，最好采用双标记实验方法。或在同一时间内将不同核素标记的同一物质，以不同途径或不同的口服方案引入同一体内，然后再进行双标记测量，并绘出两条曲线和计算出两个相应的AUC。进行这类实验时，不仅要注意区别示踪剂及其代谢产物，也应注意示踪剂剂量。若两个示踪剂剂量不相同时，应进行归一化处理。二、物质吸收部位的研究食物在消化道内的吸收，是指各种食物的消化产物、水分和盐类等物质通过肠粘膜上皮细胞进入血液和淋巴液的过程。不同物质在消化道的吸收部位是否相同，只能借助核素示踪技术来解答，因为它能有效地区别开内源性和外源性物质，根据消化道不同部位外源性示踪剂的放射性
9、活度的变化来确定该类物质的吸收部位。为进行这方面的研究，常采用下列几种实验方法。 （一）离体肠段实验 离体肠段实验，是取出部分肠段，将其翻转过来，结扎两端成肠袋，所以又称为翻转肠袋法。因去除淋巴管和血管，属非生理性的实验。将肠袋放在含示踪剂的缓冲液内培育，观察袋中放射性示踪剂出现的情况，以反映粘膜吸收的速度。这类实验主要是依据扩散原理设计的。将肠管粘膜翻转向外，以扩大与标记物的接触面积和吸收面积，同时被吸收物质出现于浆膜侧，因其容积小，可准确地进行微量吸收测定。虽然这种实验与机体条件相差较大，但有一定的研究意义。此法多用于有无逆浓度梯度吸收、吸收方向及影响吸收的代谢阻断剂及其类似物的研究。（二
10、）观察不同肠段腔内示踪剂含量的变化食物的吸收主要发生在小肠内，如铁，虽然小肠是主要吸收地点，其中十二指肠吸收得特别快。又如示踪实验证明，45Ca既可在肠道内吸收，又可由肠道排出。为证明45Ca在肠道内吸收的确切部位，曾给大鼠口服45Ca的可溶性盐，在不同时间间隔内杀死大鼠。分段测定肠内容物的放射性。结果发现，在最初的几小时内，肠道内容物的放射性活度已降至原活度的50；其中小肠上23的放射性最强，可见Ca的吸收主要在小肠的上23段处。这方法是一种普通的研究方法，但关键在于收集不同肠段的内容物。（三）口服示踪剂后观察消化道壁内示踪剂含量的变化本方法适用于吸收后在肠壁内停留时间较长的物质，如脂肪。曾
11、有人在给大鼠口服125I-橄榄油后26 h内，分批杀死大鼠，取出小肠，洗去内容物后并将其分成4段，然后分别测定各段肠壁的放射性。结果发现在自上而下的第三个14段壁内的放射性最高。若预先切除该段，并将第2个14与第4个14肠段吻合，再口服125I-橄榄油进行上述实验，则不会出现类似的峰值。这就表明，脂肪在小肠的第3个14段吸收率最高。（四）测量消化道不同部位血液中示踪剂的含量此法原理与测定血液中示踪剂的浓度或AUC相似，所不同的是该方法将被研究物质引入特定的观察部位，可用对比的方法研究其与口服或静脉注射示踪剂吸收率的差异。这种方法多用于药物学研究。常用的方法有两种：用手术方法将欲研究的部位与消化
12、道其他部位离，仅保持血循环，再将示踪剂引入其中，测量血液浓度或 AUC。此方法又可分为急、慢性两种。切除欲研究的部位，比较研究切除前后血液中示踪物浓度的变化或AUC。该方法可用于外科手术治疗的病人。如用此法研究125I-胆固醇在肠道内的吸收情况时，发现回肠至少吸收口服胆固醇的60。三、物质吸收时化学形式的研究食物在消化道中需经过一个极复杂的化学过程才能被吸收。但因食物成分的降解、吸收及吸收后在肠壁内发生的变化是一个连续的动态变化过程，用一般生化方法是很难进行分析的，这无疑对阐明食物吸收的形式带来了困难。因此，营养学家常需借助于核素示踪技术来研究上述问题。（一）单标记实验研究此类实验常将待研究物
13、质的不同组成部分加上标记核素，制备成不同的标记物A与B。口服后测定血液或淋巴液中的放射性，追踪标记原子的去向，以确定待研究物的吸收形式。如脂肪吸收的研究，已知膳食中的脂肪主要是甘油三酯（或三脂肪酰），为了解吸收入血浆的游离的脂肪酸和甘油是否是甘油三酯的直接组成成分，分别用羧基上带14C标记原子的游离脂肪酸和14C-甘油进行实验。结果表明，肠粘膜可以吸收游离脂肪酸，并发现1012C以下的脂肪酸，如癸酸能直接扩散入门静脉，但不参加甘油三酯的合成； 7090的长链脂肪酸被小肠粘膜吸收后，参与合成甘油三酯并进入淋巴液中；而14C-甘油很少出现在甘油三酯中。因为甘油被吸收后，直接进入肝脏，或被ATP活化
14、为3-磷酸甘油，供合成甘油三酯时应用，游离的甘油不能在肠壁内参与甘油三酯的合成。现已阐明甘油三酯在小肠粘膜内的再合成主要是以2-单酰甘油为基础，与长链脂肪酰辅酶A结合成甘油三酯。（二）双标记示踪实验此类实验是利用在分子不同部位带有不同标记原子的示踪剂进行的双标记实验，以追踪两者的去向，对具有病理作用的物质胆固醇酯的吸收方式的研究是这类实验的代表。如Shiratori和Goodman的实验，利用3H标记苯环上7位和14C标记脂肪酸羧基的胆固醇酯进行其吸收方式的研究。结果发现，胆固醇酯中的胆固醇与脂肪酸吸收率不同，被吸收的脂肪酸主要出现在甘油三酯中，出现在胆固醇酯中的量很少；淋巴液中胆固醇酯的脂肪
15、酸主要是非标记的内源性脂肪酸。可以说，胆固醇酯在消化道内先水解成游离的胆固醇和脂肪酸，然后分别被吸收。脂肪酸主要参与甘油三酯的合成；而游离胆固醇主要与内源性脂肪酸形成胆固醇酯。第二节 物质分布与转运的研究生物体内的物质处于不断更新与动态平衡之中，各种物质在机体内都有各自的分布与转运规律。打破了这种规律，就会出现病理改变。因此，讨论物质的体内分布与转运规律，不仅有利于了解生理活动，同时对探讨某些疾病的发病机制也有重要的意义。药物在体内发挥作用，也必须通过一定机制转运并在作用的器官、细胞或细胞器中有高度的富集，以达到最大的药效比。放射性核素示踪技术则是研究物质分布与转运的较为理想方法。一、研究方法
16、物质分布与转运的研究方法相似，而物质转运的实验设计更强调动态观察，基本研究方法均包括示踪剂的引入、实验观察与实验结果的处理3个步骤：。实验观察方法主要是放射自显影和取标本测量示踪物的含量。无论采用哪种方法，都应该区分示踪物和带标记的产物。此外，在分布研究中还应该注意时间因素的影响。 另外，根据研究目的的不同，物质分布与转运研究划分为4个水平：宏观水平（器官水平）、细胞水平、亚细胞水平和分子水平。二、物质分布实验（一）物质分布研究 标记物的分布是研究物质结构与功能间互相关系的前提。为精确地确定标记物的分布，要注意下列问题。 1.示踪剂的引入根据研究水平的不同，示踪剂的引入方法也不同。器官水平的物
17、质分布研究，需由静脉或腹腔（小动物多用）引入示踪剂，有时须经特殊途径（如侧脑室注射）给整体动物引入示踪剂。对结构精细的、量极少的物质或生物大分子，进行亚细胞水平或分子水平的研究时，应采用离体实验，试管内给予示踪剂的方法。 2.示踪剂对示踪剂的选择除遵守一般的原则外，在物质分布的研究中，必须注意下列几点：使用的标记化合物不一定要求严格的定位标记，因为此项研究目的在于观察物质的分布而不是物质的转化。要求示踪核素原子应标记牢固，不脱落或交换。标记物的放射化学纯度要高，否则会产生错误的研究结果，尤其在中药研究用同位素交换法制备标记物时，更应注意。示踪剂比活度依据研究水平而定，器官水平研究需要放射性比活
18、度较低的示踪剂；亚细胞水平和分子水平的研究需用高比活度的示踪剂。3.标本的处理实验中要根据研究目的和测量方法进行样品的处理和标本制备。但应指出的是,用层析或电泳等方法分离示踪剂与代谢产物时，往往会导致示踪剂或代谢产物的丢失。因此，实验中需作丢失校正，常称为回收率校正。回收率校正可通过预实验或平行实验求出平均回收率，作为分布实验的校正因子（不同类型或不同量的组织回收率不同，应分别求出校正因子）进行校正，而最好的方法是用双标记示踪方法。如用示踪剂A作分布研究，示踪剂B作回收率测定，并要求两者的化学结构相同或相似。若标记核素不同时，配制的工作液的放射性浓度必须严格标定。双标记法作回收率校正的实验步骤
19、如下：向含标记物A的实验体系中加入一定量的、已知放射性活度为DB的示踪剂B，取组织制备匀浆，纯化后制成样品；进行双标记测量A、B两示踪剂的总活度为 DADB；计算回收率=DBDB；计算标本中标记物A的活度，即DA=DA回收率。在对比研究中，若各组织的回收率基本相同，可不作回收率校正。4.数据处理分布实验中数据处理的关键在于合理地选择参数。以取标本测量示踪剂含量为例来讨论数据处理中的问题。示踪剂的量以Bq为单位，若样品的测量效率相同时，也可以用cpm为单位。无论是哪一级水平的分布研究，都将测得的dpm换算成放射性含量，如Bqg组织或 BqmL液体,Bq106个细胞，Bqmg蛋白质或DNA,Bqm
20、g核酸，以反映示踪剂在组织或组织某一组分中的浓集程度，并可保证不同的组织标本间的可比性。离体实验时，试管中给予相同剂量的示踪剂，放射性计数可直接相比较。整体实验若以每克组织给予相同的示踪剂，组织标本间也可相互比较。若每克体重投入示踪剂的量不同时，可用两种方法进行校正：将测得的组织放射性含量除以每克体重给予的示踪剂的量；测定实验动物血浆中的放射性含量，将组织或某组分放射性含量除以血浆的放射性含量。后一种方法能排除示踪剂清除率不同造成的影响。可见，合理地选择参数，保障数据的可比性，可为以后的统计处理打下基础。(二)物质分布实验的应用物质分布示踪研究广泛地应用于药理学和毒理学研究中。如用放射自显影法
21、观察到14C-氟烷主要分布在大脑和小脑白质，奠定了氟烷起全身麻醉作用的理论基础。又如我国学者用14C-鱼腥草素作分布实验，研究鱼腥草素对支气管炎的疗效时，发现14C-鱼腥草素在气管组织内有一定的浓集。近年来，又设计出一些特定的标记物作为探针（probe）,根据它们在体内的分布，研究对它们有特异亲和力的配基在不同水平上的分布情况，能够对其结构与功能间的关系进行更深入的了解。在这方面较突出的应用有标记抗体、标记的互补RNA（DNA）及标记的受体配基。随之发展起来的放射免疫显像与治疗、DNA原位分子杂交、反义核酸显像及放射性反义核酸双重治疗、受体配基分析、放射受体显像与受体介导靶向治疗等技术，已成为
22、肿瘤、遗传性疾病和内分泌系统疾病的病因研究和诊断、治疗中不可缺少的研究手段。三、物质在血浆与组织间的转运物质转运的研究包括血液和组织间的转运、细胞内外的转运及亚细胞结构与细胞浆间的转运。物质的转运与细胞的生理活动、疾病的发病机制关系密切。放射性核素示踪技术能够在转运双方原有物质浓度不变的情况下进行研究。所以，已成为物质转运研究不可缺少的手段。血液和组织间物质转运的示踪研究应用广泛。通常是在示踪剂引入血液后的不同时间内，取组织或者同时取血液和组织进行示踪剂含量的测定。这类实验主要应用于以下3个方面：（一）动态平衡的证实这类实验是依据下面的事实设计的。组织中某种物质的含量稳定不变，却经常能与血液进
23、行交换，当向血液内引入放射性标记的该种物质后，放射性会出现在组织中，停止向血液中引入标记物后，组织中放射性便逐渐降低。利用此类实验已证明：像表面静止的骨骼中的Ca却与血浆Ca间进行不断地交换，这是因为血浆Ca的浓度是稳定的，不允许其中的Ca不断地增加或减少，否则，只能由Ca库即骨中Ca来进行调节和交换，这种交换处于动态平衡中。此外，45Ca示踪实验结果显示骨骼中的Ca处于不断地交换中，不是静止不变的。（二）组织中物质来源的判断胆固醇是影响人类动脉粥样硬化的重要因素之一。为了判断动脉粥样硬化斑快中胆固醇的来源，将l14C-胆固醇加入饲料中喂养家兔，其血浆中胆固醇的放射性会逐渐升高，并维持在一定的
24、水平，定期杀死动物，测定动脉壁中胆固醇的放射性。实验发现，动脉壁胆固醇的放射性逐渐增高，最后其比活度与血浆相同，即达到平衡。因此，便把这类实验称为同位素平衡实验（isotope balance experiment）。利用这种实验证明了动脉壁中胆固醇来源于血液中的胆固醇。两者并处于不断地交换之中。（四）血浆运载蛋白的研究许多物质在血浆中不是以游离态存在的，如某些激素、无机物和药物等，是以与某些特定的血浆蛋白相结合的形式而被转运的。已研究证明的运载蛋白有甲状腺素结合球蛋白（TBG）、皮质醇结合球蛋白（CBG）、性激素结合球蛋白（SHBQ）、运铁蛋白（TF）、脂蛋白（lipoprotein）等。用
25、放射性核素示踪方法不仅能证实这种结合，而且能通过放射自显影或放射性扫描等方法在电泳谱或层析谱上找出这种运转蛋白，可进一步对其质与量进行研究。此项工作除有助于阐明运载蛋白的生理作用外，尚可对其病理作用进行研究。如用3H-胆固醇研究低密度（LDL）和高密度（HDL）脂蛋白在动脉粥样变中的作用时，发现缺乏高密度脂蛋白的人，即使血浆总胆固醇含量不高，也易发生动脉粥样硬化。四、生物膜两侧的物质转运生物膜包括细胞膜和亚细胞颗粒成分与胞浆间的界面结构。生物膜两侧物质的转移不同于一般的半透明膜，除单纯扩散外，还有主动转移（即在“泵”的作用下，物质能逆梯度转移）和易化转运（即在膜结构中的某些蛋白质帮助下，扩散速
26、度超过一般的物理扩散）。虽然很久以前就开始了对生物膜两侧物质转运的研究，但只有在运用放射性核素示踪技术之后，这类研究才得到迅速发展。常用的研究方法如下：（一）单纯扩散研究这方面的研究无论是离体还是整体实验都有很多例证。将标记物加在生物膜的一侧，观察另一侧的放射性以判断物质扩散的速度，如有人曾用24Na观察多种动物和人不同妊娠期的胎盘向胎儿转移的情况，发现24Na在母体血液和胎儿体内达到平衡的速度缓慢。应指出脂溶性物质的单扩散速度与其油水分布系数（脂溶性的强弱）和分子量的大小有关。（二）主动转运和易化扩散的研究在这类研究中不一定需要放射性核素示踪技术，因为有些物质，如单糖和氨基酸在肠道内的吸收和
27、肾小球的重吸收，可以通过测定浓度梯度，或观察立体结构的特异性和比较分析结构类似物等，来证实物质的主动转移。但当被研究的物质在生物膜两侧都存在时，浓度虽不相同，却是相对稳定的，或两侧浓度都很低，常采用核素示踪技术进行研究。近年来用此法研究水溶性维生素在肠道中的吸收时，发现有的维生素能逆梯度地进入肠粘膜细胞，再进入浆膜外液。这种转移有立体结构的特异性和可饱和性，往往需要Na+的存在和供给能量。所以，称之为钠泵依赖性主动扩散。VitC、VitB1和生物素等的吸收都属于这一类。五、亚细胞水平的物质转运亚细胞结构间的物质转运与细胞功能调控有密切关系，近年来这方面的研究发展很快。常用的实验方法如下：（一）
28、电镜自显影动态观察例如在研究Ca对肌细胞生理功能的调控作用时，便是利用45Ca体外掺入肌细胞，连续定期取样作电镜自显影观察，发现45Ca在肌细胞不同的活动状态时分布不同，肌肉松弛时，45Ca主要分布在肌质网的终末池，收缩结束时则聚集在粗肌丝，结束后不久又回到终末池。（二）分离亚细胞组分作放射性动态观察 这类实验是利用密度梯度离心分离法和放射性核素示踪法，对研究的组织作动态观察。如利用3H标记的神经递质或化学前身物作脑室注射后，取出脑组织制成匀浆，并进行梯度离心，分离不同的亚细胞成分并进行液闪测量。测量结果发现3H标记物主要集中在神经元的突触结构中，与电镜自显影的观察结果相一致。（三）制备亚细胞
29、结构间物质转运的模型这一方法是用一定的化学程序处理破坏细胞膜的特殊转运机制，但细胞不被破碎，使之成为研究亚细胞组分间物质转运的模型。如用皂甙处理肝细胞，使其胞浆中的成分能自由地通过胞膜，为研究磷酯肌醇（InsP3）和细胞内钙（45Ca）的关系提供了模型。根据放射性测量结果发现，细胞器（可能是胞质网）中45Ca的释放随InsP3增多而增加，这一事实还间接地证明了这两个细胞调控因子间的互相关系。第三节 物质转化的示踪研究研究物质转化的目的主要是揭示机体内重要生命物质的前身物、中间物和代谢产物的关系，以及完成这种物质转化的必要条件等。由放射性核素示踪技术本身的特点所决定，它已是完成这类实验研究的关键
30、手段。常用的实验方法如下所述：一、掺入实验（一）掺入实验掺入实验（incorporation experiment）可研究生物体系中化合物A和B的前身物与产物的关系。用放射性核素（或稳定核素）标记在化合物A的适当部位上，引入生物体系内，经过一定的时间，分离出化合物B,凡若在化合物B中出现较多的标记核素，就表明化合物A的标记原子或标记基团或整个标记分子已掺入到化合物B中，即化合物A是化合物B的前身物。（二）掺入实验的分类掺入实验分为整体（in vivo）和离体（in vitro）掺入实验两类。整体掺入实验多采用动物实验，选用合适的标记物也可以进行人体实验。整体实验有利于观察某一物质在体内转化的全
31、部情况。但由于体内代谢过程复杂，一般用实验不容易了解代谢转变过程的细节，如甘氨酸是甲基是卟啉碳的主要前身物，但用标记的甘氨酸作整体掺入实验，却因代谢旁路多及内源性甘氨酸的影响，掺入率不高，难以作出判断。离体掺入实验在研究物质转化过程时，实验条件易控制，有利于在分子水平上阐明转化过程的具体步骤、转化条件及影响因素。特别是有些物质向中间物转化缓慢、产量极少，但中间物却能迅速地向产物转化，对这种情况只有进行离体掺入实验才可以得到预期的研究结果。一般离体掺入实验的生物材料常是组织切片、组织匀浆、细胞悬液、亚细胞颗粒或无细胞酶系统。其中，应用较多的是组织匀浆，它不仅可以直接给出物质转化的某些信息，也是初
32、步研究阶段的实验对象，还可以根据实验的要求，对其作进一步的处理，或获得丰富的细胞膜、细胞器或其他亚细胞成分。细胞悬液也是常用的生物材料，标记物可直接加入到培养体系中。可是，离体实验破坏了代谢系统的完整性（包括特定的亚细胞结构膜及有关的调节、催化、血管系统），其结果与整体实验不能完全一致，必须用整体实验进行验证，方可作出可靠的结论。（三）掺入实验的步骤首先根据待测物的结构特点，选择适当的前身物，在一定的部位进行标记。并要求示踪剂具有高比活度和高放化纯度。按照预实验选定的最佳条件进行实验，最后分离的产物也应达到要求的放化纯度。这样获得的结果才可靠。（四）主要参数掺入实验最常用的参数之一是掺入百分率
33、（Incoporation Percentage），它表示相对的掺入量，所以也称为相对掺入量，利用下列公式可对前身物和产物的关系作出定量分析。 （13.2）掺入百分率表明加入的前身物分子能转变为产物的百分率。上式中产物的总放射性不一定能反映出前身物转化为产物的总量或速度，因机体内存在内源性的前身物，所形成的产物不带放射性，放射性产物则被稀释。为消除前身物和产物分子量不同的影响，通常用比活度来表示各自放射性的多少，即mmol 或umol物质的放射性。一般常以它们的比值来反映相互间关系，该比值称为相对比活度（relative specific activity）。 （13.3）相对比活度表示的是标
34、记前身物转化为标记产物的速率,或者是标记前身物的利用率，即所谓的掺入率（incorporation rate）。掺入率的高低又和多种因素有关，如实验对象、标记物加入时间、中间物和产物代谢库的大小、转换速率等。应指出,前身物和产物的比活度要同时测量。公式13.3中前身物比活度是指标记前身和内源性前身物混合后的测定值。在离体实验中常使用过量标记前身物，整个实验过程中标记物的比活度基本上不会变化，可以直接用产物的活度来代表相对比活度。（五）般掺入实验的应用一般掺入实验通过对掺入率的测定，便能对两种或两种以上的代谢物间的关系作出定性分析，追踪物质转化的途径。当某一标记物作为待测物的前身物，进行掺入实验
35、时，便可从待测物获得较高的掺入率。如果标记物是待测物的有效前身中间产物，掺入率会更高。例如15N-甘氨酸是血红蛋白的有效前身物，便是利用15N标记的甘氨酸进行掺入实验证明的。实验不仅发现甘氨酸内的15N被直接用来合成卟啉，并证明其他氨基酸内的15N只能间接地利用，利用率也低。由于血红蛋白形成后固定在红细胞内，一旦红细胞破坏后也不会再被利用。所以，15N-甘氨酸掺入血红蛋白的实验，在医学研究中被用来测定红细胞的寿命，以阐明正常红细胞和各种疾病时红细胞寿命的变化规律与机制，对疾病的诊断具有十分重要的意义。当然，选择合适的标记前身物，也可以对粒系和巨核系细胞的寿命进行研究。尤其是近年来，定量掺入实验
36、被引进到细胞学领域内，用来反映细胞功能的变化，作为诊断指标。如用淋巴细胞转化实验检查机体的免疫功能；又如用3H-TdR掺入DNA作为细胞增殖指标，以反映处于周期的细胞数量和细胞的增殖能力。生物医学常将这一指标用于研究肿瘤细胞的增殖活动；在临床医学中该指标能部分地代替白血病患者骨髓细胞的形态学检查，并作为药物疗效的指标。应指出利用掺入实验作为物质转化研究，通常都是针对欲分析部位选择定位标记化合物为前身物，即前身物一定部位的原子或基团带有标记，产物的掺入率是该部位原子或基团转化而来的信息。分析结果时，应注意将特定原子或基团与整个分子区别开来。二、双标记掺入实验双标记掺入实验是示踪研究常用的技术之一
37、，具体实验原理与方法见第十二章。在物质转化研究中，双标记掺入实验作为追踪研究的手段用于阐明前身物的一个或两个以上的基团，或同一基团的不同原子是否能直接转移到产物上，还是需要经过中间变化（部分脱落、分解后再合成），最后形成产物。这类实验常采用两种核素分别标记前身物分子的不同部位，实验前要测定示踪剂中两种核素的放射性比活度或两种稳定核素的丰度（以原子百分超为单位；放射性核素以cpm为单位），计算两者之间比值，分析实验结果时将其与产物中两者之比值相比较，若产物中两核素比值保持不变，即表示上述两个标记部位的原子直接转化到产物中。这类掺入实验的一个典型例子是常见的体内转甲基过程。已知蛋氨酸是甲基的直接供
38、给体，核酸、肾上腺素和胆碱合成时需要的甲基都是由蛋氨酸供给的。因此，有人用不同的核素如14C和2H，分别标记蛋氨酸的甲基，并按一定比例混合于饲料中，喂养大鼠。然后分离大鼠肌肉组织中的肌酸和胆碱，分别测定甲基上的14C和2H，计算2H14C的比值。发现甲基上的2H14C比值几乎没有变化，表明体内的甲基作为一个整体基团参加了代谢过程。又如在嘌呤合成代谢中，甘氨酸分子作为一个整体直接加入到嘌呤的骨架中，也是由14C和15N双标记的甘氨酸进行的掺入实验证实的。分析产物中两种核素的比值，与前身物相比较，变化较大时，便说明前身物分子的特定基因不是整体地掺入到产物中。如用C-3标记14C和N-甲基基团标记3
39、H的N2-甲基色氨酸作前身物，进行实验，测定产物，发现产物中3H14C的比值明显下降，表明前身物的N-甲基不是作为完整基团直接掺入到产物中，其反应式如下：双标记技术还可以用来比较不同的前身物掺入产物的情况，以确定前身物与产物间的关系。这类实验常采用一定比例的不同核素标记的前身物的混合物进行实验，如二甲基丙烯色氨酸是麦角生物碱的直接前身物就是用这类实验证实的。此外，双标记技术另一个重要作用是，在掺入实验中追踪个别原子的踪迹，即测定前身物中一个特定的标记原子（一般指氢原子）是否能直接掺入到产物中，以及掺入的程度。这类实验常用两个指标：参考标记（reference label）和指示剂标记（indi
40、cator label）。前者用以表示前身物分子骨架的具体转变情况，所以要求核素标记在已证实的能够转变为产物的部位上；后者用以表示特殊基团或原子在反应过程中保留的情况,因此，常用保留率（retention percentage）表示前身物的转化情况。 (13.4)通常用14C作参考标记，3H作指示剂标记。如在研究色氨酸和蛋氨酸形成吲哚霉菌素时，证明了在甲基化过程中蛋氨酸甲基的3个氢原子都被保留，甲基作为完整的单位掺入到吲哚酮酸上。三、产物标记部位分析此类实验对探讨前身物与产物间的关系更有意义，能够寻找出前身物与产物分子间特定部位规律性的联系。在进行此类实验前，首先对前身物和产物的分子结构进行比
41、较，利用已获得的知识制备几种可能的前身物，作特定部位标记物进行掺人实验。分离出的产物，用有机化学方法将产物分子降解成小碎片，测定和分析标记原子在这些碎片中的含量和分布。若产物中某一定部位上的原子分布和具有特定位置标记的前身物间存在着规律性联系，即设想的前身物便是产物的直接前身物。若产物中仅有少量掺入或其分布表现不规律，即表明设想的前身物与产物间没有直接关系，如乙酸是胆固醇的直接前身物就是利用此方法证明的。利用双标记的乙酸和大鼠肝组织切片一起温育，然后分离出产物胆固醇，经化学降解后分析胆固醇每个碳原子中同位素的浓度与性质，结果发现胆固醇的碳原子都来源于乙酸的甲基或羧基。应指出，分析标记原子在产物
42、分子中的分布，通常采用化学降解方法，为了使实验结果准确可靠，保持降解过程中放射性的平衡是非常重要的，即反应过程中所形成的碎片的放射性比活度之总和，应与前身物的比活度相近似（以每克分子计算放射性比活度）。可是，对复杂的产物进行标记部位分析时，因化学降解法繁杂、费时，实验结果也易受各种因素的影响。近年来，质谱仪（MS）和核磁共振仪（NMR）已成为测定标记化合物中标记原子的有力工具。 四、放射性核素标记技术用于蛋白质翻译后修饰的研究蛋白质翻译后修饰在细胞的生长、增殖和分化的调控中发挥重要的作用。研究蛋白质翻译后修饰可以采用放射性核素标记的方法。体外培养细胞时，如果将放射性同位素标记到氨基酸或氨基酸前
43、体并加入到培养基中，放射性同位素就将掺入到新合成的蛋白质分子中。 如果用对特定修饰基团特异的放射性前体，就可以检测各种蛋白质的翻译后的修饰。一般常见的蛋白质翻译后修饰有磷酸化、O-糖基化、N-糖基化、十四烷基化、十六烷基化（表13-1）。表13-1 常见的放射性标记技术用于蛋白质翻译后修饰研究放射性标记物标记时间培养基翻译后修饰类型32P-正磷酸2 h无磷酸盐磷酸化（9，10-3H）-豆蔻酸4 h标准+10%胰冻磷酸肉汤十四烷基化（9，10-3H）-软脂酸4 h标准+10%胰冻磷酸肉汤+5 mmol/L丙酮酸钠十六烷基化3H-半乳糖、3H-甘露糖、3H-岩藻糖可变化 标准O-糖基化3H-半乳糖
44、、3H-甘露糖、3H-岩藻糖可变化标准N-糖基化最值得注意的是蛋白质的磷酸化测定，由于蛋白质的磷酸化程度由其蛋白激酶和磷酸酶的相对活性来决定，它们是一对拮抗酶，酶活性的平衡受细胞周期的调控及各种环境因素的影响。因而，监控蛋白质的磷酸化水平、特异性位点及其对靶蛋白的影响，对了解蛋白质磷酸化如何调控从质膜到胞核的信号传导过程，了解细胞周期进程如何受调控酶系磷酸化的控制，是非常有意义的工作。一般蛋白质的磷酸化的定量测定常用32P-正磷酸掺入实验来完成。将37370 MBq 32P -正磷酸加入到无磷酸的培养体系中，与细胞培养2 h到平衡；测定胞内32P-ATP或胞外32P-正磷酸的比活性（表示平衡）；提取蛋白并用双向凝胶电泳或免疫沉淀后单向凝胶电泳分开目的蛋白；测定蛋白质的浓度及其放射性并计算蛋白质磷酸化的数量。蛋白的电泳谱带可以用放射自显影来进行定位和定量,也可以用高效液相色谱来完成相关工作。
