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1、分子生物学知识点总结 1.蛋白质组(proteome)：proteins expressed by a genome,即基因组表达的全套蛋白质。蛋白质组学（Protemics）则是以蛋白质组为研究对象，从整体角度，分析细胞或组织内蛋白质构成的动态变化和活动规律的科学。（相互作用网络 PPI）2.表达蛋白质组学研究的基本流程：蛋白样品的制备及定量-总蛋白的双向凝胶电泳（染色）-凝胶分析软件分析-胶内酶解（胰肽酶）-质谱分析（肽质量指纹图谱）-数据库搜索鉴定蛋白性质 3.双向凝胶电泳：相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，先经等电聚焦电泳(isoelectric focusin
2、g，IEF)，再经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）把复杂的蛋白质成分分离。4.比较蛋白质组学：通过比较同一个体肿瘤细胞（组织）与正常细胞（组织）之间蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异，发现与肿瘤发病或者发展有关的分子标记，用来作为肿瘤诊断的肿瘤相关蛋白。5.软电离：所谓“软电离”是指样品分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。6.肿瘤血清蛋白质分析方法（tumor serologic proteome analysis，SERPA）：是从肿瘤免疫学观点出发建立的一种蛋白质组学和肿瘤免疫学相结合的方法。SERPA 其实验过程如下：双向电泳分离肿瘤组织（细胞）总蛋白质
3、；转膜；建立 western blotting 蛋白质印迹反应图谱（与患者或正常人血清反应）；软件分析确定差异反应的蛋白质斑点；质谱鉴定和生物信息对肿瘤组织平行胶(replica gel)中相应的差异蛋白质点进行鉴定，筛选出肿瘤分子标志物；用 ELISA、免疫组化等方法对该分子标志物进行原位验证，或者进一步分析该蛋白功能，研究其在肿瘤进展中发挥的作用。7.蛋白质芯片：是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面，形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。8.功能蛋白质组学：是指对蛋白质间、蛋白质与DNA/RN
4、A间的相互作用的研究。以细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质为主要研究内容，由此建立细胞内外信号传递的复杂网络。研究方法主要有：蛋白质芯片技术 目前常用蛋白质芯片有：1.SELDI-TOF-MS 蛋白质芯片 2.抗体芯片 3.靶蛋白质芯片 4.液相蛋白质芯片 噬菌体展示技术 酵母双杂交系统 免疫共沉淀 9.免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。10.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理：根据蛋白质分子量不同分离复杂蛋白质成分。1.制备凝胶试剂
5、：丙烯酰胺（单体）；亚甲双丙烯酰胺（胶联剂）二者比例 29：1；母液浓度 30%；过硫酸铵（引发剂 引发交联）；N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）(加速剂)十二烷基磺酸钠（SDS）（阴离子变性剂）2.蛋白上样缓冲液 3.电泳缓冲液 4.考马斯亮蓝 R250 染色液 5.脱色液 11.Western blotting 基本原理:将SDS-PAGE 分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)上,在膜上进行固相免疫化学染色,原位显示蛋白质带,从而在已知分子量的基础上对蛋白质进行定性、定量分析。12.Southwestern blotting 基本原理:细
6、胞核蛋白提取物经 SDS-PAGE 后,转移至NCM 上,然后用标记的 DNA 探针检测转移至膜上的蛋白质。细胞死亡形式 表现 Cell death 细胞坏死 Apoptosis PCD:细胞生命现象不可逆的停止细胞结构和功能的不可逆丧失。细胞死亡并非与机体死亡同步。正常组织中也发生细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。细胞受到外来的急性的强力的致病因素作用下，细胞正常代谢活动被强行中断而引起的“意外”的、被动性死亡过程；只见于病理情况下。细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀。核染色质随机降解呈絮状,蛋白合成减少。细胞膜、溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起周围炎症 指在一定的生理和病理条件下，多细胞
7、有机体为调控机体发育、维持内环境稳定，由基因控制并遵循一定程序的细胞主动性死亡过程.又程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD).凋亡小体：胞膜皱缩内陷、反折，包围凝集断裂的染色质、胞质、细胞器等形成芽状、泡状突起并分离脱落，形成一些有膜包被，内涵物不外溢的小块，称凋亡小体（apoptotic body）。多细胞生物体在生长发育过程中，细胞在基因调控下，按照一定时空顺序发生的受到严格程序控制的生理性死亡。“特殊的定时自杀”PCD Apoptosis 功能性概念 发育学概念 形态学概念 仅存在于发育细胞 可存在于发育和成体细胞 大部分凋亡是 PCD。PCD 的最终结果是
8、凋亡 某些凋亡是非程序性。如细胞毒物诱导的凋亡 13.凋亡的生物学意义 1、确保正常生长发育、2、维持内环境稳定、3、防御功能 14.细胞凋亡的形态学特征：细胞皱缩;2.细胞质浓缩;3.染色质边集核膜下，呈块状、新月形，4.凋亡小体形成；5.凋亡小体内有结构完整的细胞器。细胞凋亡的生化特征：染色质 DNA 片段化内源性核酸内切酶活化，将核小体间的连接 DNA 降解，形成长度为 180200bp 整倍数的寡聚核苷酸片段。在琼脂糖凝胶电泳中呈特征性的“梯状”条带（DNA ladder：细胞凋亡时 DNA 在核小体间断裂(DNA fragmentation)形成一些 DNA 片断，经过提取和纯化后在
9、凝胶电泳上产生 n 条梯状条带，故称之为 DNA Ladder，是判断 DNA 损伤的重要标准）15.Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一组对底物的天冬氨酸部位有特异水解作用的，活性中心富含半胱氨酸的蛋白水解酶。Caspase 功能：1.细胞骨架蛋白和核纤层蛋白，导致细胞解体成凋亡小体 2 激活 DNA 酶（Caspase-activated DNase，CAD）。CAD:Caspase 激活的 DNA酶正常情况下 CAD 与其抑制剂 ICAD 结合，在胞质内，无活性。凋亡时 Caspase水解 ICAD,游离的 CAD 有活性，进入胞核，切割 DNA。3 灭活凋亡抑制物:如
10、Bcl-2、ICAD 4 水解与 DNA 损伤修复相关的酶和蛋白质 如聚 ADP 核糖多聚酶（poly-ADP-ribose polymerase,PARP）16.死亡受体途径-外源性途径：死亡受体 TNFR1、Fas、CAR1、NGFR、DR3、DR4、DR5 等是一类通过与相应配体结合，传递细胞凋亡信号的细胞膜蛋白。通路（pathway）死亡配体（细胞外）-死亡受体（细胞膜）-相关蛋白（中介蛋白，细胞质内）-激活 Caspase8激活 Caspase3-细胞凋亡 17.线粒体损伤途径-内源性途径：线粒体是细胞生命活动的控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡的调控中心
11、。释放细胞色素 C（Cyt.c）释放凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）和限制性核酸内切酶G（Endo G）释放 Smac/Diablo(the second mitochondria-derived activator of caspase,Smac)(direct IAP bingding protein,Diablo)释放活性氧 ROS 18.细胞周期：1.G1 期（first gap）从有丝分裂到 DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成 RNA 和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成 RNA 和蛋白质，细胞体积显著增大。这一期的主要
12、意义在于为下阶段 S期的 DNA 复制作好物质和能量的准备。2.S 期（synthesis）即 DNA 合成期，在此期，除了合成 DNA 外，同时还要合成组蛋白。DNA 复制所需要的酶都在这一时期合成。3.G2 期（second gap）期为 DNA 合成后期，是有丝分裂的准备期。在这一时期，DNA 合成终止，大量合成 RNA 及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。4.M 期：细胞分裂期。19.细胞周期蛋白或周期素（Cyclins)：一类结构类似、能结合并调节 CDK 活性的蛋白家族，哺乳动物至少有 10 种，14 个成员（cyclin A、B1-2、C、D1-3、E、F、G1-2、H、I、K
13、）。cyclins-CDKs-CKIs 系统 20.HIF-1a：几乎参与了对糖酵解每一步的调控；PI3K/Akt 途径；Myc；P53 等 21.Cyclin：周期素/周期蛋白，是 CDK（周期素依赖的蛋白激酶）的调节亚基，分别在细胞周期的不同时期积累，激活 CDK，使其具有催化关键底物的磷酸化修饰并调节其活性。参与细胞周期中不同时相的调节。22.G1/S检验点：在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restriction point)，控制细胞由静止状态的 G1进入 DNA 合成期，相关的事件包括：DNA 是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？23.cyclin box：
14、各类周期蛋白均含有一段约 100 个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白盒(cyclin box)，是与 CDK 相互作用的活性区域。24.RNA 干扰(RNA interference，RNAi)是将双链 RNA 导入细胞内引起特异基因的 mRNA 降解的一种细胞反应过程。属于转录后基因沉默的一种。25.试述 CDK1 活性的调控机制？CDK 的催化活性受到激活因素与抑制因素两方面的调节。激活因素中，目前认为CDK与周期素的结合以及保守的苏氨酸残基的磷酸化是较为重要的两种调节因素。抑制因素中，CDK 的 N-端氨基酸残基的抑制性磷酸化以及抑制蛋白的结合是主要的调节因素。磷酸化修饰的激活作用：CDK
15、 的激活还必须依赖于其保守的苏氨酸残基的磷酸化，如在人 CDK1（p34cdc2）的 Thr161 和CDK2 的 Thr160 的磷酸化，就与这两个酶的激活相关。催化 CDK1 和 CDK2 磷酸化的酶是 CAK（CDK activiting kinase），是另一种蛋白激酶 CDK7-Cyclin H 复合物。当磷酸酶-1 将此位点的磷酸水解，P34cdc2 又失去激酶活性。磷酸化修饰的抑制作用在人的 CDK1 和 CDK2 中，Thr14 和 Tyr15 残基的磷酸化可抑制 CDK 的催化活性。催化 Thr14 和 Tyr15 磷酸化的是两种不同的蛋白激 酶，使 Thr14 磷酸化的为蛋
16、白激酶 Myt1，使 Tyr15 磷酸化的是蛋白激酶Wee1/Mik1。催化 Thr14 和 Tyr15 脱磷酸化的是蛋白磷酸酶 CDC25。26.DNA 损伤又称基因突变：是 DNA 复制过程中发生的 DNA 核苷酸序列的改变，从分子水平看是 DNA 分子碱基顺序或数目的改变。突变的形式包括：替换、插入、缺失、重排。27.突变形式：（一）点突变：指 DNA 分子上一个碱基对的变异，碱基替换包括：转换（同型）、颠换（异型）典型疾病：镰刀型细胞贫血，碱基颠换 AT-TA；（二）插入和缺失-框移突变（frame-shift mutation）:缺失和插入引起的三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨
17、基酸种类、排列顺序发生改变。(地中海贫血)（三）重排：指 DNA 分子内发生较大片段的交换，也称重组。移位的 DNA 片段可在新位点颠倒方向反置（倒位），也可在染色体之间发生交换重组。突变的意义：产生新基因，出现新性状，为生物进化提供了最原始、最根本的的材料，是进化的分子基础 28.DNA 损伤的修复：指针对已发生的缺陷而进行的补救机制。直接修复：修复酶识别出损伤部位直接修复，不用切除 DNA 或切除碱基。包括1.光修复、2.链断裂的直接重接、3.碱基的直接插入、4.转甲基作用 切除修复(excission repair)：在 DNA 内切酶、外切酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶等多种酶的共
18、同作用下，先将 DNA 受损的单链部位切除，然后以另一条链为模板，合成一段正确配对的碱基序列来修补缺口。DNA 损伤最普遍的修复形式。切除修复的特点：（1）切除修复利用的是化学能 ATP，也叫暗修复。（2）修复发生在复制前。（3）修复的对象是亲代 DNA。重组修复：当 DNA 损伤较大、较严重，无法及时修复或缺乏切除修复酶系统，可跳跃损伤部位复制，子链形成缺口，复制结束后，在重组基因 rec 编码的酶（Rec 蛋白）、DNA 聚合酶、DNA 连接酶等的作用下，将无损母链的 DNA 片段移到子链缺口，进行重组修复。发生在复制后，故又称“复制后修复”DNA 损伤重组修复的过程及特点：过程：（1）复
19、制：损伤母链复制时，越过损伤部位，子链对应位点留下空缺；无损母链复制成完整双链。(2)重组：空缺诱导产生重组酶(Rec 蛋白)，RecA 与空缺区结合，并催化子链空缺与无损母链相应片段重组交换(RecBCD 蛋白);有缺子链与无损母链重组，空缺转移到无损母链，有缺子链完整，损伤母链仍然保留。(3)再合成：转移后的母链空缺以新的互补子链为模板，在 DNA 聚合酶和连接酶的催化下，重新修复缺口;DNA 链的损伤并未除去，随着复制的继续，损伤链将在群体中逐步“稀释”。修复发生在复制后，对象是子代 DNA.SOS 修复：DNA 严重损伤难以复制或 DNA 复制系统受抑制的紧急情况下，为了保证 DNA
20、链的完整性，应急产生校对功能低的修复酶，采用填补任意碱基的修复方式。这是具有差错的修复，是对极为不利的外界环境的应急反应，故称 SOS 修复，也称差错倾向修复。SOS 反应广泛存在于原核生物和真核生物。细胞能存活，但变异率高，DNA 保留错误较多，会引起广泛、长期的突变。自然界也因此而变得生物种类繁多。信号转导通路 29.受体：是细胞膜上或细胞内可以特异地识别与结合化学信号物质（配体）并能激发靶细胞产生特异生物效应的特殊蛋白质分子。G 蛋白：广义的 G 蛋白是指所有能与 GTP 或 GDP 结合的蛋白质。细胞信号转导中扮演重要角色的 G 蛋白主要有两类：异三聚体 G 蛋白（与膜受体偶联，位于细
21、胞膜内侧，由三个亚基组成，一般称为经典 G 蛋白或大 G 蛋白。）、单体 G 蛋白（存在于不同的细胞部位的小分子量 G 蛋白，也称为“小 G 蛋白”，是单亚基蛋白。Ras 是第一个被发现的小 G 蛋白。）SH2 结构域：由约 100 个氨基酸残基组成，中心为反向平行的 片层结构，两侧为 螺旋。SH2 介导信号分子与含磷酸酪氨酸蛋白分子的结合，并与磷酸化酪氨酸的磷酸基团结合。这种结合依赖于酪氨酸残基的磷酸化及其周围的氨基酸残基所构成的模体（motif）。不同的蛋白质分子含有结构相似但并不相同的 SH2 结构域，因此对于含有磷酸化酪氨酸残基的不同模体具有选择性。SH3 结构域：由 55-75 个氨
22、基酸残基组成,形成一个扭曲 桶状结构。SH3 结构域介导信号分子与富含脯氨酸的蛋白分子的结合，其亲和力与脯氨酸残基及邻近氨基酸残基所构成的模体序列相关。30.1.简述细胞膜受体的类型及其特征：2.举例说明 cAMP-PKA 信号传递途径。cAMP 对肌细胞中糖原分解合成的调节作用 肾上腺素分泌，与膜受体结合，通过 G 蛋白偶联激活腺苷酸环化酶催化 ATP生成 cAMP，cAMP 通过激活 PKA（依赖 cAMP 的蛋白激酶）行使功能，PKA*3.试述 RTKRasMAPK 信号传递途径。该途径的信号分子：生长因子类 EGF、PDGF、IGF、FGF、VGEF 等 RTK：受体酪氨酸激酶（与配体
23、结合及受体二聚化/寡聚化使酶激活）Ras 蛋白：Ras 蛋白是细胞内的一种小分子单体 GTPase，像其它单体 GTPase 和 G蛋白三聚体一样，非活化状态时结合 GDP，在外源信号的作用下释放 GDP，结合GTP，本身即被激活，Ras 蛋白亦具有 GTPase 活性，将 GTP 水解成 GDP，Ras 蛋白本身又回到非活化状态。但 Ras 蛋白水解 GTP 的速度比 Gs至少慢 100 倍。肾上腺素肾上腺素MAPK：有丝分裂原活化蛋白激酶或微管相关蛋白激酶，属 Ser/Thr 激酶，是接受膜受体转换与传递的信号并将其带入细胞核内的一类重要分子，在多种受体信号传递途径中具有关键性作用。31.
24、抑癌基因（tumor suppressor gene）：又称为抗癌基因（antioncogene）是一类在正常情况下对细胞增殖有负调控作用，而在两个等位基因都缺失或失活时可促进肿瘤形成的基因。常见的有 p53、Rb、VHL、APC 32.p53 的功能：（1）抑制 cyclin A 的表达；（2）抑制 DNA 聚合酶与 DNA 复制起始复合物的结合；（3）激活抑制细胞分裂的基因；（4）抑制癌基因对细胞的转化。33.基因诊断:采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构(DNA 水平)或功能(RNA 水平)是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。是病因的诊断。分子生物学相关实验 34.
25、PCRPCR-RFLPRFLP：多聚酶链式反应-限制性片段长度多态性分析，靶基因 PCR 扩增、扩增的 DNA 片段限制性酶切图谱（长度多态性）。主要用于核酸变异性分析与比较。35.PCRPCR-SSCPSSCP（诊断有无突变）（诊断有无突变）：聚合酶链反应-单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism)的简称，原理是将经扩增的 DNA 片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无突变。广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基因的多态性分析等。
26、并不能鉴别所有的突变。36.PCR-southern blot 或 Dot blot 技术：是将 PCR 扩增产物转移到硝酸纤维膜或尼 龙膜上，再与标记的特异性探针进行杂交，然后放射自显影，来检测有无特定的扩增片段及相对含量，现已广泛应用于癌基因、遗传特异基因、病原体特异基因等方面的研究及检测。37.核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的DNA/DNA，RNA/RNA，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。38.原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行(in situ hybridization)杂交,叫原位杂交。可用于 DNA、RNA 定位研究。
27、39.DNA 印迹技术(Southern blotting)：Southern 印迹杂交常用于探测 DNA 的限制性内切酶图谱。通过检测某个体特定基因及旁侧区域限制性内切酶图谱的变化，可判断是否发生了明显的 DNA 突变。PCR 过程及原理：又叫体外基因扩增技术。利用人工合成的一对引物，在被扩增DNA 模板链的两端形成双链，由 DNA 聚合酶催化一对引物之间的聚合反应。组成体系：template DNA.at least a couple of primer（长度：20bp 左右;碱基分布:均匀随机，G+C 含量:40-60%;引物自身不存在发卡结构;两个引物间不能互补；引物与非特异靶区段同源
28、性不能超过 70%；5端可修饰（酶切位点）-方便基因隆）；Taq 酶；四种底物 dNTPs；buffer（包括 Mg2+）。过程：变性：将双链 DNA 加热（95）使之变性，DNA 双链变成单链 退火：降低温度至 56使引物与模板 DNA 单链结合 延伸：将温度升至 72，在 DNA 聚合酶作用下，在引物 3 端进行延伸，使原模板 DNA 的一条链变成两条链。Taq 酶的特性：a)耐热 b)缺乏校正活性(3-5外切酶活性)，相对容易错误掺入 c)合成速度:1200bp/min d)在新链 3-端额外加上一个 A e)有 5-3 外切酶活性，可以 real time PCR 40.DNA 芯片技
29、术：是指将许多特定的 DNA 片段或 cDNA 片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。41.基因转移的方法：1.逆转录病毒载体（生物学）；2.脂质体；3.直接注射；4.受体介导基因转移技术；5.磷酸钙共沉淀法；6.电穿孔法；7.基因枪法；8.显微注射法。42.RNAi（RNA interference）：是指在生物体细胞内，短双链 RNA（dsRNA）引起同源 mRNA 的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程。一种转录后水平的同源靶基因沉默，RNAi 能达到基因敲除的效果。43.SiRNA 制备方法比较 44.基因工程一般步骤：1.分离目的基因（化学合成、制备 DNA 文库
30、、制备基因组文库、PCR）；2.DNA 切割（限制性内切酶 vector 和目的基因片段）；3.连接；4.转化：b）E.Coli 细胞转化:CaCl2 法制备感受态细菌 a)真核细胞转化:b)micro-injection(微注射)(细胞核大)c)磷酸钙共沉淀法(贴壁细胞)d)electroporation(电穿孔,电激,电击)(悬浮细胞)e)基因枪(贴壁细胞/组织块)f)liposome(脂质体)5.筛选重组体：蓝白筛选(-互补法)；营养缺陷互补法；抗生素抗性互补。gene manipulation 45.45.Expression vectorExpression vector：就是在克隆
31、载体的骨就是在克隆载体的骨架的基础上增加表达原件，如启动子、目架的基础上增加表达原件，如启动子、目的基因、终止子、标记基因，使目的基因的基因、终止子、标记基因，使目的基因能够表达的载体。能够表达的载体。46.PlasmidPlasmid：质粒，指一种小环状质粒，指一种小环状 DNADNA 分子分子，存在与细胞染色体外，能够自主复制存在与细胞染色体外，能够自主复制产生产生特定的功能特定的功能。47.LncRNALncRNA：长链非编码长链非编码 RNARNA，由基因组编码，由基因组编码产生，长度大于产生，长度大于 200200 个核苷酸，没有编码个核苷酸，没有编码蛋白的能力。蛋白的能力。48.P
32、 Palindromealindrome：回文序列回文序列，也叫作反向重复也叫作反向重复序列，指核酸序列的序列，指核酸序列的 55-3 3 方向与其另一方向与其另一条链相同。条链相同。49.49.CRISPRCRISPR：是一种来自细菌降解入侵的病毒：是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNADNA 或其他外源或其他外源 DNADNA 的免疫机制，的免疫机制，Cas9Cas9 蛋白有两个核酸酶结构域，可以分别切割蛋白有两个核酸酶结构域，可以分别切割 DNADNA 的两条单链。的两条单链。C Casas9 9 先与先与 crcrRNARNA及及 tracrRNAtracrRNA 结合成复合物，然后通过
33、结合成复合物，然后通过 PANPAN 序列结合并侵入序列结合并侵入 DNADNA，形成，形成 RNARNA-DNADNA 复复合结构，进而对目的合结构，进而对目的 DNADNA 双链的切割，使双链的切割，使 DNADNA 双链断裂。双链断裂。50.基因工程常用的酶：限制性内切酶、反转录酶、基因工程常用的酶：限制性内切酶、反转录酶、TaqTaq DNADNA polymerasepolymerase 51.请设计一个请设计一个 QRTQRT-PCRPCR 实验，简述其原理，过程。（可以结合文献，举例说明）。实验，简述其原理，过程。（可以结合文献，举例说明）。qRT-PCR：（荧光定量 PCR）在
34、 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程中每一轮循环产物的累积数量，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。逆转录-聚合酶链反应，提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA.反应体系：SYBR Premix Ex Taq：含有 TaKaRa Ex Taq,dNTP mixture,Mg2+,SYBR Green I 等。52.52.请设计一个载体，在大肠杆菌细胞中表达一个目的基因（举例说明）。请设计一个载体，在大肠杆菌细胞中表达一个目的基因（举例说明）。Recombina
35、nt DNA Technology-Process of cloning:1.Isolation of target gene（分离目的基因）2.Selection and construction of vectors（载体的选择和构建）3.Ligation of target DNA and vector（载体与目的基因结合）提取质粒，限制酶切割质粒，用限制酶从其他组织切割目的基因暴露粘性末端。载体与目的基因结合得到重组质粒，重组质粒导入 E.coli 中 4.Transformation of target gene into receptor cell（目的基因导入受体细胞）Intro
36、duction:transformation (E.coli)transfection (Tumor cells)infection (Virus)。5.Screening for recombinant plasmids（重组质粒的筛选）6.Expressing a cloned gene（克隆基因的表达）53.内含子：真核生物细胞 DNA 中的间插序列。含调控序列，参与基因表达。54.外显子：为蛋白质氨基酸编码的 DNA 序列。55.基因组：一个细胞或者生物体所携带的一套完整的单倍体序列，包括全套基因和间隔序列。56.真核细胞基因组的特征 DNA 量大、断裂基因/含有内含子和外显子、重复序
37、列（出现原因：基因的多拷贝、与染色质的构象着丝点的形成有关、参与表达调控，染色质 DNA 的“区间性”）、不存在操纵子结构、57.微卫星(microsatellite)：遍布于人类基因组的短小重复序列，每一重复序列为 1bp 6bp，重复次数不超过 60 次，片段长度小于 350 bp。58.操纵子(operon)：由功能相关的一组结构基因(structural genes)串联在一起，包括上游的调控区共同构成。59.试述转录前水平的表达调控的方式：基因丢失（体细胞分化过程中，必须将某些基因永久性关闭。最简单有效的方式是将这些基因丢失。将要分化为生殖细胞的细胞则一直保留着整套基因组）、扩增（发
38、育分化、环境条件的改变，对某些基因产物的需要量急剧增加增加该基因的拷贝数）、重排（某些基因片段改变原来存在的顺序重新排列组合。）、甲基化修饰（脊椎动物中，DNA 上特定的 CpG 序列处 C 可发生甲基化修饰（5mC）、染色体结构。60.CpG island：具有 CpG 二核苷酸簇的500 碱基的区域(至少 55%G+C 含量，0.65 或更大比率的观察和预期o/e CpG 二核苷酸频率)，定义为 CpG 岛。61.顺式调控元件(cis-acting element,CAE)：基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的 DNA 序列。包括启动子（与 RNA 聚合酶结合并起动转录的 DNA 序列
39、）、增强子、沉默子。62.增强子(enhancer)：增强启动子功能，促进基因转录活性。必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用。作用方式：具有组织特异性。无基因特异性。无方向性。可位于上下游远距离作用。(3000bp)具有相位性。具有一定空间相位。63.反式作用因子(trans-acting factor)：由位于不同染色体或同一染色体上相距较远的基因编码的蛋白质因子。结构：一个完整的反式作用因子含有 2 个必不可少的结 构 域，即 DNA 结 合 结 构 域(DNA binding domain)和 转 录 活 化 结 构 域(trans-activating domain)。反
40、式作用因子通过前者与 DNA 特定序列结合，通过后者发挥转录活化功能。反式作用因子的作用机制：（1）转录因子相互作用、（2）竞争性排除组蛋白、（3）与核基质蛋白作用（空间网络状结构）、（4）DNA 解旋作用。64.RNA 剪接：将 hnRNA(核不均一 RNA）中的内含子序列切除，外显子部分连接起来，称为 RNA 剪接。65.表观遗传学（epigenetics）：表观遗传学是研究不涉及 DNA 序列改变的基因表达和调控的可遗传修饰。66.反义 RNA(anti-sense)：一段含有与被调控基因所产生 mRNA 互补碱基序列的小分子 RNA。67.RNAi：作用是生物体内的一种通过双链 RNA
41、 分子在 mRNA 水平上诱导特异性序列基因沉默的 过程。由于 RNAi 发生在转录后水平，所以又称为转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing,PTGS）mRNA 的研究方法 Northern Blot：定性、半定量；RT-PCR：定性、定量 原位杂交：定性、定位、半定量 cDNA 芯片：反义 RNA、RNA 干扰、MicroRNA、转录组 蛋白质的研究方法 Western Blot：定性、半定量 免疫组织化学：定性、定位、半定量 抗体芯片：蛋白质组学：2D-PAGE/2 Dimensional-PAGE:二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。
