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1、课题1 微生物的实验室培养,（一）培养基：具体配方可以不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。,选择培养基,加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物加入四环素、卡那霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞,可抑制细菌、放线菌细胞壁主要成分肽聚糖的合成,其细胞壁是由纤维素、几丁质、葡聚糖组成,菌落:,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。,（二）无菌技术,1.无菌技术的概念：,
2、无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,消毒定义：,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,灭菌定义：,是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽胞、孢子）。,是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽胞和孢子。,消毒的方法：1、煮沸消毒法：100煮沸56min2、巴氏消毒法：7075下煮30min或80下煮15min3、用体积分数为50%70%酒精溶液等进行皮肤消毒4、氯气消毒水源5、紫外线消毒,灭菌的方法：1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160170下加热12h3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持1530min,3.常用的消毒与灭
3、菌的方法：,是指用紫外线（能量）照射杀灭微生物的方法，紫外线不仅能使核酸、蛋白质变性，而且能使空气中氧气产生微量臭氧，从而达到共同杀菌作用。,1、灼烧灭菌：,灭菌的方法：,2、干热灭菌：160170下加热12h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121条件下维持1530min。,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作
4、者的双手,思考：,三、实验操作,（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）,1.计算 2.称量 3.溶化4.灭菌 5.倒平板,操作步骤：,配方：,倒平板技术,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,讨论：,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后
5、，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,（二）纯化大肠杆菌,接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法,平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面.在数次划线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.,不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。,1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.2.划线首尾不能相接3.
6、划线后,培养皿倒置培养,划线分离法注意事项:,其他画线分离图：,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,讨论：,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太
7、高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,涂布分离法:是指将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个的细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等.,结果分析与评价,培养12
8、h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同,（一）培养基的制作是否合格,如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,（二）接种操作是否符合无菌要求,如果培养基上生长的菌落的颜色、形状大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。,（三）是否进行了及时细致的观察与记录,菌种的保藏,1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法,1.提示：可以从微生物生长需要哪些条件的角度来思考。例如，微生物的生长需要水、空气、适宜的温度，食品保存可以通过保持干燥、真空的条件，以及冷藏等方法来阻止微生物的生长。2.提示：可以从这三种培养技术的原理、操作步骤等方面分别进行总结归纳。例如，这三种培养技术都需要为培养物提供充足的营养，但无土栽培技术的操作并不需要保证无菌的条件，而其他两种技术都要求严格的无菌条件。3.提示：这是一道开放性的问题，答案并不惟一，重点在于鼓励学生积极参与，从不同的角度思考问题。例如，正是由于证明了微生物不是自发产生的，微生物学才可能发展成为一门独立的学科；巴斯德实验中用到的加热灭菌的方法导致了有效的灭菌方法的出现，而这一灭菌原理也适用于食品的保存等。,
