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1、目前，甲硫氨酸的生产方法主要为化学合成法，该方法存在污染大、耗能高 且产物不易分离等诸多不利因素，国内外研究学者及生产者不断寻求环境友好的 微生物发酵法替代此方法生产。但目前微生物发酵法难以实现工业化生产，其主 要原因为微生物体内合成的代谢系统较为复杂，受到严格的调控作用，使得碳流 竞争激烈无法为甲硫氨酸提供足够碳骨架。甲硫氨酸合成途径中的关键酶，受到 副产物赖氨酸及苏氨酸严格反馈抑制及反馈阻遏，影响了甲硫氨酸的合成。需要 改造具有解除末端氨基酸抑制作用的高酶活性突变菌，促使更多的碳流量进入甲 硫氨酸合成途径。本实验室以抗结构类似物北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)
2、 E31为基 础，对天冬氨酸族氨基酸代谢途径的关键酶进行研究，发现了单体酶AK,筛选 出影响AK及HSD活性的多个关键残基位点，构建了多株高酶活性且解除反馈 抑制作用的菌株。谷氨酸棒杆菌具有代谢调控系统简单、遗传背景清晰且无致病性等优点，常 被用来生产天冬氨酸家族氨基酸。对谷氨酸棒杆菌代谢途径进行改造，通过不同 遗传操作手段逐步探究合成途径阻遏关键位点。在对合成途径关键酶AK、HSD 及高丝氨酸乙酰基转移酶(HAT)进行改造的基础上构建串联过表达载体，以增 强各关键酶的表达量，最终通过实时聚合酶链式反应(real-time PCR)、高效液 相色谱分析基因表达情况及氨基酸变化情况，探究碳流阻遏
3、点。并对苏氨酸支路 thrB的底物高丝氨酸结合位点A20进行酸性、碱性、极性和非极性4种类型8种 不同氨基酸定点突变研究，筛选相比于原菌酶活性降低的突变体。以期为规模化 微生物发酵法生产提供理论基础。1过表达连接及real-timePCR分析本研究组已对北京棒杆菌AS 1.299基因组AK及HSD进行克隆、突变和筛 选研究，并对所得突变体进行酶动力学分析，其中AKM372、T379位点是抑制 剂赖氨酸结合口袋的关键残基且高度保守，突变体AKM372I/T379W有效削弱了 赖氨酸与结合口袋附近残基的结合，解除了赖氨酸对AK的反馈抑制作用，突变 后最适PH值减小，耐受范围变广，半衰期有所延长，相
4、比WTAK活性提高36.37 倍。HSD第206位点在家族中高度保守，参与底物的结合，突变成异亮氨酸后 侧链官能团减小，空间位阻降低，更有利于与底物结合，HSDL200D相比于WT HSD活性提高了 17.68倍。基因扩增及载体构建结果如图1所示。图IA中，扩增AK目的基因IysCm为1 274 bp,扩增HSD目的基因homm 为1 338 bp,扩增HAT目的基因metX为1 140 bp。扩增所得长度与目的片段大 小相符，证明各连接目的片段扩增成功。图IB中，穿梭表达载体PECXK99E 大小为7 018 bp,重组载体扩增得到4 000 bp左右IySCm-SD-homm-SD-met
5、X连 接片段，证明过表达载体构建成功。以谷氨酸棒杆菌的DnaE基因作为内参基因，对野生型谷氨酸棒杆菌WTgl 及过表达菌株 WTg 1/PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX 中 IysC hom 和 metX 基因 进行 real-time PCR 分析。结果显示，WTg 1 PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX 中 IySC、hom和metX的表达量分别为出发菌株WTgl中对应基因表达量的6.896、 2.378倍和1.659倍，表明AK、HSD及HAT基因串联过量表达有效。2过表达菌株高效液相色谱分析分别对野生型菌株 WTgl 和过表达菌株 WTg 1 PEC-
6、lysCm-SD-homm-SD-metX进行微生物发酵培养，并对72 h发酵上清 液进行反相高效液相色谱检测，结果显示，过表达菌株天冬氨酸、谷氨酸积累量 降低显著，无明显积累；苏氨酸和异亮氨酸产量同步降低；赖氨酸产量相应提高, 甲硫氨酸产量明显提高。过表达AK使得碳源流经三较酸循环后更易流经天冬氨酸下游支路氨基酸 的合成，使得Glu产量由原菌的1.45 g/L减少到0.07gLo real-time PCR分析可 见过表达后HSD转录水平提高到2.378倍，使得天冬氨酸积累量降低至0.09 g/L,碳流量途经中间酶AK及HSD不会产生过多积累，更有利于下游氨基酸的 合成。过表达HAT使苏氨酸
7、由原菌2.93 g/L降至1.61gL,赖氨酸产量变化不大, 甲硫氨酸产量相比原菌提高到2.26倍，达到4.14 g/L。结合real-time PCR及液相色谱氨基酸分析，改造并过表达甲硫氨酸支路关 键酶可有效促进碳流量，减少谷氨酸棒杆菌代谢途径中主要谷氨酸积累，提高了 甲硫氨酸产量。同时发现，经改造后菌株WTg 1 PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX 代谢途径中苏氨酸积累量过多，是甲硫氨酸合成途径碳流竞争的第一大氨基酸。 推测如果有效减少苏氨酸产量将更有利于提高甲硫氨酸产量，故本实验试图对苏 氨酸支路首个关键酶thrB进行弱化研究。3thrB突变载体构建本实验从谷氨酸棒杆菌
8、基因组上扩增HSK目的基因thrB进行PET-28a表达 载体连接。进行1%琼脂糖核酸电泳验证，图2A中，基因组扩增thrB靶片段为 1 000 bp,重组载体PET-thrB为6 369 bp,连接载体双酶切验证，两条明显条带 分别于IoOobP及5 00ObP左右，这与目的片段及线性化载体大小相符。图2B 为重组载体突变后PCR扩增电泳，证明质粒在引物作用下实现了大量的复制。 目的片段送于生工生物工程（上海）股份有限公司测序，连接成功。4 thrB突变株酶活性筛选及分析野生型和突变体经非变性银柱纯化后进行12% SDSPAGE验证实验（图3）。 野生型和突变体纯化酶在12%SDS-PAGE
9、的37 kDa左右处均存在单一明亮条带, 表明thrB突变体蛋白在诱导剂IPTG的作用下表达成功，可用于酶动力学测定及 酶学性质表征。本实验对thrB进行酸、碱、极性和非极性4种性质8种氨基酸进行定点突 变，并对突变体进行酶动力学研究及酶学性质表征，结果显示，HSK 20位点丙 氨酸突变成8种不同氨基酸后酶活性多数降低，由各菌株Vmax可以看出其中 突变体thrB-A20H及thrB-A20Y的酶活性降低较为显著，分别为WT-thrB的43% 及39%,最适温度升高至30 和35 oCo碱性氨基酸组氨酸最适PH值增加至 8.5,半衰期延长，更有利于微生物发酵生产蛋氨基酸。突变体thrB-A20
10、Y酶活性降至原菌39%,酶活性降低最为显著，对该突变 位点进行原子间静电力及Pymol图谱分析，见图4。静电势由74.552 kJ/mol变 为74.573 kJ/mol。酪氨酸侧链较大，与底物高丝氨酸的空间位阻增大距离变远, 导致高丝氨酸不能很好地进入底物结合口袋，影响酶与底物结合效率，使酶活性 降低。结论本实验通过在谷氨酸棒杆菌内串联表达合成途径关键酶基因LySCm、homm 和metX,获得菌株WTgl/PEC-IySCm-SD-homm-SD-metX,有效增加了合成途径 的碳流量，使积累量大幅度提高，达到4.14 g/L,实现了产量的提高。实验对苏 氨酸支路关键酶thrB基因进行定点
11、突变研窕，获得多株酶活性降低突变株，其 中thrB-A20Y活性降至原菌39%,为微生物体内弱化苏氨酸支路、增强甲硫氨 酸积累提供理论基础。异亮氨酸生产菌的全局代谢网络改造策略加, WM. MW、I 2 MLotaudn【摘要】L-异亮氨酸是一种支链氨基酸，也是人体必需氨基酸，可作为食品 营养补充剂、药物和饲料添加剂。本文主要综述了谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌合成 L-异亮氨酸的调控机制和全局代谢网络改造策略现状，重点阐述基因工程技术在 L-异亮氨酸产生菌改造中的应用。【关键词】L-异亮氨酸基因工程改造策略Abstract L-isoleucine is a branched-chain amino
12、 acid and an essential amino acid for humans. It can be used as a food nutrition supplement, medicine and feed additive. This article mainly reviews the control mechanism of L-isoleucine synthesis by Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli and the status of global metabolic network transform
13、ation strategies, and focuses on the application of genetic engineering technology in the transformation of L-isoleucine producing bacteria.Keywords L-isoleucine genetic engineering modification strategy异亮氨酸是一种支链氨基酸，也是人体必需氨基酸，在食品领域主要用于食 品添加剂，在医药领域主要用于氨基酸输液成分之一，而且它的需求量在逐年增 加口。传统意义上的L-异亮氨酸生产菌株大多数是由野生菌
14、株经过物理或化学 的方法经过多轮诱变筛选获得。研究发现，基因突变往往充满着很多不确定性，而且在高通量筛选菌种时工 作量较大，此外反复使用同一种诱变因子可能会出现钝化现象并且引起微生物的 回复突变，使诱变育种变得不易控制2。基因工程技术的发展为L.异亮氨酸高产菌株的筛选提供了全新选择，该技 术主要基于目前研究人员对L.异亮氨酸合成途径和调控机制的深入了解，定向 改造有利于L-异亮氨酸合成的某些基因或其代谢途径，使碳源最大化流向L-异 亮氨酸同时解除L-异亮氨酸的自身反馈抑制，因此利用这种方法获得的L-异亮 氨酸高产菌株产量高且遗传性状稳定。IL-异亮氨酸的合成途径与调控机制谷氨酸棒杆菌是L-异亮
15、氨酸生产菌的常用菌株，其产L异亮氨酸的生物合 成途径、调控机制及其运输系统如图1所示。L天冬氨酸首先经过L-天冬氨酸 激酶（AK）、天冬氨酸半醛脱氢酶（ASD）、高丝氨酸脱氢酶（HDH）、高丝氨 酸激酶（HSK）和苏氨酸合酶（TS）催化的五步酶学反应转化生成L-苏氨酸3。 AK由IySC基因编码合成，其活性受到L-苏氨酸和L-赖氨酸协同反馈抑制，是 L-异亮氨酸合成途径上的第一个关键酶;HDH由horn基因编码，是L-异亮氨酸 合成途径上的第二个关键酶，调控HDH催化的酶反应是控制碳流流向支路的关 键之处，其表达受到L-甲硫氨酸的轻微反馈阻遏;HSK是由thrB基因编码，可将 高丝氨酸磷酸化形
16、成磷酸高丝氨酸，可控制流向苏氨酸合成的碳流，其酶活性受 到L-甲硫氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制，是L-异亮氨酸合成途径上的第三个关键 酶;苏氨酸脱水酶（TD）对苏氨酸的脱氨基，可控制L-苏氨酸到L-异亮氨酸的碳 流，是L-异亮氨酸合成途径上的第四个关键酶;乙酰羟基氨酸合酶（AHAS）催 化丙酮酸和2-酮基丁酸生成乙酰羟丁酸，由于该酶还可以催化合成L-缴氨酸和 L.亮氨酸，所以其决定了不同产物的碳流，是L-异亮氨酸合成途径的第五个关 键酶4-5。大肠杆菌是另一个常用的L-异亮氨酸生产菌株，它的L-异亮氨酸生物合成 途径及调控机制如图2所示，与谷氨酸棒杆菌略有区别6。L-天冬氨酸先经五 步反应合成L
17、-苏氨酸，L-苏氨酸再经五步反应后生成L-异亮氨酸，与谷氨酸棒 杆菌不同的是AK有三个同工酶为AK I H和I,分别由thrA、metL和tysc 编码。AKI . 和In具有不同的调控机制，在基因水平上，thrA和tysc的表达 分别由L-苏氨酸和L-赖氨酸诱发的转录衰减调控，而metL的表达则由L-甲硫 氨酸诱导的阻遏蛋白MetJ调控在蛋白质水平上，AKI和AKIl是双功能蛋白， 同时具有天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶的活力，分别受L-苏氨酸和L-赖氨酸 的反馈抑制调控。大肠杆菌中有三个乙酰羟基酸合成酶（AHAS）的同工酶，分 别为AHAS I、和HI并分别由由ilvBN、ilvGM和ilv
18、lH编码与AK类似，这三 种同工酶具有不同的调控机制。ivGM的表达由异亮氨酸诱发的转录衰减调 控。这三种AHAS同工酶竞争同一个底物丙酮酸，丙酮酸是支链氨基酸合成的 重要前体，相比之下HvBN编码的AHASI对丙酮酸的亲和力远高于对2-酮基丁 酸的亲和力。因此,AHASI主要参与L-亮氨酸和L-缀氨酸的生物合成，而AHAS II和HI主要参与L-异亮氨酸的合成7。2 L.异亮氨酸的代谢工程改造2.1 运输载体改造对L-异亮氨酸产量的影响研究发现，L-异亮氨酸的产率与 跨膜转运机制有密切的关系。Morbach S等对谷氨酸棒杆菌发酵生产L.异亮氨酸 的研究发现胞内L-异亮氨酸浓度始终大于胞外L
19、-异亮氨酸浓度8, Kelle R等人 发现高浓度的L-异亮氨酸对细胞有毒害作用91。BrnFE是谷氨酸棒木旱菌中负责 支链氨基酸L-异亮氨酸、亮氨酸和缀氨酸转运运输的双组份转运载体，由bmFE 基因编码，当谷氨酸棒杆菌胞内的支链氨基酸量积累到一定程度时，便会激活 brnFE操纵子表达使得L.异亮氨酸等氨基酸外排到胞外。通过过表达brnFE基因，可以减少异亮氨酸在谷氨酸棒杆菌胞内的积 累，削弱L异亮氨酸在胞内对合成途径中关键酶的反馈抑制作用，从而增加其 产量。李忠财等人在谷氨酸棒杆菌LD320中分别过表达突变型和野生型的双组 份转运系统BrnFE操纵子，构建了重组菌LD320pXMJ19-br
20、nFEl通过添加适量 的表面活性剂，通过7L发酵罐放大实验，发现该菌株L-异亮氨酸的产量由18.53 g/L提高到25.45 gL10o大肠杆菌中，支链氨基酸(BCAAS)的输出蛋白bmFE 高效表达也可提高L-异亮氨酸产量。2.2 辅酶改造对L-异亮氨酸产量的影响L-异亮氨酸所需的关键辅酶是 NADPH,它也是ASD. HD、乙酰羟酸合酶(AHAIR)的辅酶，止匕外NADPH 还是细胞内最重要的还原力在还原性生物合成中起到氢供体的作用。细胞内 NADPH的主要供应渠道是HMP途径和NAD激酶，其中HMP途径利用氧化态 辅酶II (NADP+)作为电子受体生成还原态辅酶H (NADPH), N
21、AD激酶则催 化辅酶I发生磷酸化生成辅酶 o研究表明，高效供应NADPH有利于发挥菌株 的合成潜力，可促进L-异亮氨酸的进一步积累。还晓静等人通过在谷氨酸棒杆 菌中过表达NAD激酶(ppnk编码)成功构建由ppnK组成表达菌 JHI3-156pDXW-9-ppnK, L-异亮氨酸的产量提高了 41.7%11;Shifeng 等人利用 辅酶工程在谷氨酸棒杆菌中增加NADPH的供应，敲除内源性NAD+激酶基因 ppnK同时将葡萄糖-6磷酸脱氢酶基因ZWf与L-异亮氨酸双加氧酶(ido)共表达 提高L-异亮氨酸的前体物质4-羟基异亮氨酸(4-HIL)的产量，L-异亮氨酸产量 达到 84.14+6.3
22、8mM12o2.3 代谢通路改造对L-异亮氨酸产量的影响231增强主合成途径2.3.1.1 通过表达关键酶以解除自身反馈根据L-异亮氨酸的生物合成途径及 代谢调节机制，使菌体最大化生成L-异亮氨酸的方法主要是增加其前体物质的 合成、解除自身反馈抑制以及切断代谢支路。通过基因工程手段能很好地改造 L-异亮氨酸产生菌的代谢通路，例如过表达某些关键酶基因可以有效解除自身反 馈抑制、敲除支链代谢的相关基因可以使碳流最大化流向目标产物。基因工程手段精准且有效地改变L-异亮氨酸产生菌的代谢通路，已成为很 多研究者青睐的方法。尹良鸿等人在谷氨酸棒杆菌JH13-156中共表达反馈抗性 苏氨酸脱水酶和乙酰羟基酸
23、合酶，经72小时分批补料发酵可生产L-异亮氨酸 30.7 gL13;徐庆阳等人通过在谷氨酸棒杆菌中过表达hom基因成功构建谷氨酸 棒杆菌YILW (pXMJ19-hom),由于解除了高丝氨酸脱水酶的反馈抑制，使得 L-异亮氨酸的产量增加了 10.3%,达到32gL 14;此外他通过异源表达钝化发现 谷氨酸棒杆菌JHI3-I56的苏氨酸脱水酶(TDI)和乙酰羟基胺酸合酶(AHASl) 均具有抗反馈抑制能力，在谷氨酸棒杆菌JHI3-156中过量表达TDl或AHASl 均能提高L-异亮氨酸的产量，组合表达时摇瓶发酵提高131.7%的L-异亮氨酸， 发酵罐发酵提高26.3%的L-异亮氨酸;李燕军等人以
24、L-苏氨酸生产菌Escherichia COliTHRD为出发菌株，利用基因重组技术替换ilvLXGMEDA启动子并过表达 解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvlH,获得了 L-异亮氨酸高产菌株ILE04, 该菌株在5L发酵罐中L-异亮氨酸的产量为5.23gL5;温冰、徐国栋等人采用 基因重组手段将L-异亮氨酸生产菌株谷氨酸把那个杆菌YlLW的UvBNC操纵子 中的启动子替换为强启动子Ptac获得谷氨酸棒杆菌YlLWPtacpXMJ 19cimA,其 L-异亮氨酸酸产量和核糖转化率分别较出发菌株提高14.8%和18.6%,在此基础 上过表达CimA基因，L-异亮氨酸羟量和糖酸转化率较出发
25、菌株提高了 14.5%和 42.4%16o2.3.1.2 增加前体物质的合成异亮氨酸的前体物质主要有天冬氨酸，苏氨酸 等，增加相关的前体物质能积累大量的目标产物。FengShi等人在重组谷氨酸棒 杆菌中过表达基因ppc （编码PEPC-磷酸烯醇丙酮酸竣化酶）和IysC （编码AK） 再将ppc和IysC与ido共表达以增加4-HIL的直接前体L-异亮氨酸的供应17; 乙酰羟基酸合成酶（acetohydroxyacid synthase, AHAS）是L-异亮氨酸合成途 径的关键酶（L-由HvBN编码），-酮基丁酸是L-异亮氨酸合成的重要前体， 因此强化ilvBN的表达以及增加（X-酮基丁酸的供
26、应理论上可提高L-异亮氨酸的 合成。赵建勋在谷氨酸棒杆菌IWJOOl中表达RRF和EF-G,后续共表达合成途 径关键酶基因ilvBNA和辅酶基因ppnk, L-异亮氨酸产量提高了 76.5%ll8o2.3.1.3 增强回补途径以增加L-异亮氨酸的产量增强回补途径是增加L-异亮 氨酸产量的重要方法，研究表明回补途径的增强确实可以提高L-异亮氨酸的产 量。ZHU FUZhOU等人以谷氨酸棒杆菌Yl为出发菌株，采用基因组整合和质粒 过表达磷酸烯醇式丙酮酸竣化酶编码基因ppc及丙酮酸竣化酶编码基因pyc,获 得pyc基因组整合和质粒过表达菌株ILEOl,摇瓶条件下L-异亮氨酸产量提高了 17.3%,发
27、酵罐条件下提高11.7%;获得ppc基因组整合和质粒过表达菌株ILE03, 摇瓶条件下L异亮氨酸产量提高了 30.8%,发酵罐条件下提高15.8%ll9o2.3.2减少副产品的积累在L-异亮氨酸的合成途径上，其他氨基酸等竞争代 谢产物的存在极大减少了 L-异亮氨酸的合成，支链代谢产物会分走很大部分碳 流，理论上减弱这些旁路氨基酸的合成，可以大大加强L-异亮氨酸合成途径的 碳流从而积累更多的L-异亮氨酸。Yuanxiao DONG等人通过敲除ddh和IySE基 因，从野生型谷氨酸棒杆菌ATCeI3869中构建不产生赖氨酸的基础菌株，通过 过表达相关基因L-异凫氨酸的产量有明显提局20。3总结及展
28、望传统上主要结合随机突变、定向筛选高产L-异亮氨酸高产菌，但是由于突 变的不确定性且筛选工作量大等原因，目前菌种改造多采用基因工程手段。基因 工程手段以菌株代谢背景清楚为前提，对一个点或多个点进行基因水平上的改 造，对代谢途径中多个关键酶高效表达以解除一些反馈抑制，此外构建新的代谢 途径逐渐走入人们视野。本文主要概述了 L-异亮氨酸生产菌的全局代谢网络改 造策略以及基因工程在L-异亮氨酸生产菌全局代谢网络改造中的应用现状，旨 在为相关研究者提供一些参考。当前，我国的相关研究也处在刚刚起步的阶段，随着系统生物学等相关学科 的不断发展，将相关学科的新技术相互结合用于选育更高产L-异亮氨酸的菌株 成
29、为新的挑战和发展方向，并且提出更精准、更全面、更合理的改造策略，使得 L-异亮氨酸成本降低且产量有明显的提升以满足日益增长的生产生活需要。参考文献1于丽男.高产L.异亮氨酸大肠杆菌的选育及其发酵条件优化的研究D. 宁夏大学，2015.王壮壮，魏佳，于海波，徐建中，张伟国.L-异亮氨酸高产菌选育及其培 养基优化J.生物技术通报，2019, 35 （01）： 82-89.引马文渐.改造谷氨酸棒杆菌生产L-异亮氨酸及PHAD.江南大学，2018.4卢正珂.重组谷氨酸棒杆菌合成4-羟基异亮氨酸的前体供应代谢工程改 造D.江南大学，2018.5董迅衍.代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产L-苏氨酸D.江南大学，
30、2016.6李燕军，张海宾，麻杰，张成林，谢希贤，陈宁.代谢工程改造大肠杆菌 合成L.异亮氨酸的研究J.发酵科技通讯，2016, 45 （03）： 133-1397榻池，应向贤，熊斌，宋清清，汪钊L异亮氨酸产生菌的代谢改造与发 酵控制策略J.发酵科技通讯,2012, 41 (03)： 19-22.S. Morbach, U. Burger, H. Peter, R. Rubenhagen, R. Steger, R. Kr?mer, Activity regulation of osmoprotectant transporters in Corynebacterium glutamicum,
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