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1、培养基配置技术1 .液体培养基贮存于4冰箱，避免光照，实验进行前放在37水槽中温热。2 .液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。3 .粉末培养基配制（以1升为例）：3.1. 细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml,pH为7.27.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成PH之误差,或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCo3粉末应分别溶解后才混合,然后用CO2气体调整pH,而非用强酸（HCl）或强碱（NaoH）,因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培
2、养基的PH易发生改变。3.2. 材料：纯水（milli-Q水或二次至三次蒸饰水，水品质非常重要），粉末培养基,NaHCO3,电磁搅拌器无菌血清瓶，0或0.2mm无菌过滤膜，PH计，真空泵，CO2气体3.3. 步骤：3.3.1. 取粉末培养基溶于70Omlmini-Q水中，搅拌使其溶解。3.3.2. 称取适量之NaHec）3粉末溶于200mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入Co2气体至饱和，约35分钟。3.3.3. 将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之PH应为7.2-74除非PH值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2气体调整
3、pHo培养基以真空帮浦通过过滤膜时，PH会升高0.1-0.2o3.3.4. 以0.1或0.2mm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4。（血清亦可加入培养基中一起过滤）3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。附-配制培养基之生长测试材料：MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)6-wellTCplate(or35mmTCdish)methanolglacialaceticacid10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)步骤：1 .以待测试培养基培养MDeKCe11,接种MDCK细胞于6-
4、wellplate(或35mmTCdish)中，每个Wen接种1X102活细胞，同时作对照组实验。2 .接种57天后，在100倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。3 .去除培养基,加入ImICamoy，S固定液(甲醇:冰醋酸=3:1),室温下静置IOmin。4 .去除固定液，水洗二次。5 .加入1ml10%Giemsasolution,室温下静置染色2-3min。6 .去除染液，水洗二次。7 .以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素.纯净水系统、电子天平
5、、PH计、磁力搅拌器。具体步骤：一.水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水二.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS,如：Hanks,D-HankS液的配制)：1 .溶解定容：将药品(NaCl8.0g,KCl0.2g,Na2HPO4H2O1.56g,KH2PO40.2g)倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至IOOOml,摇匀即成新配制的PBS溶液。2 .移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馈水补充蒸发掉的
6、水份。三.胰蛋白酶溶液的配制与消毒:胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在PH为8.0、温度为37时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,1:D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。1 .称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需
7、要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4内过夜。2 .用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20C保存以备使用。四.青、链霉素溶液的配制于消毒1 .所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。2 .具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。3 .使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位=1微克？五.RPMI1640的制备与消毒：1 .溶解、调PH值、定容：先将培
8、养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次（冲洗液一并加入培养基中）,充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml,使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至IoOOm1,摇匀。2 .安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。3 .抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。4 .分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4冰箱内待用。5 .使用前
9、要向IOoml培养液中加入ImI谷氨酰胺溶液（4C时两周有效）。六.血清的灭火：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56C水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。七 .HEPES溶液：HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N-a-hydroxythylpiperazine-N-ethanesulfanicacid对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的PH范围。使用终浓度为10-5Ommol/L,一般培养液内含20mmolLHEPES即可达到缓冲能力。lmolLHEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPTS238.3g,加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤
10、除菌，分装后4C保存。注意：因为现在市售HEPES为约IOg包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20mmol/L。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入IL培养液中，或者每IOOmI培养液中加入2ml即可。八 .谷氨酰胺：合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4C下放置1周可分解50%,故应单独配制，置于20C冰箱中保存，用前加入培养液。加有
11、谷氨酰胺的培养液在4C冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为14mmolL。可以配制20Ommol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至IOOml即配成20OmmOlzL的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，20保存，使用时可向IOOmI培养液中加入ImI谷氨酰胺溶液。九 .肝素溶液的配制：含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ugmlo因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时;可将其溶于IOOml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为O
12、使用时，向IOOmI培养液中加入Iml（精确可加入0.9ml）即可。十.I型胶原酶：0.1%1型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为I型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入IOml小瓶-2（C保存。十一.明胶溶液：因为明胶难于过滤，所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成IoomI溶液）一即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中，4C保存。其他培养用液的配制：20ugml内皮生长因子，注意事项：1 .配制溶液时必须用新鲜的蒸储水。2 .安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。3 .配制RPMII640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2,可在配制时调PH至7.4o
