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1、附录A（斐料性）肝胆肿瘤类器官培养用试剂材料与操作技术要点1主要试剂材料1.1 培养基主要构成表A1肝胆肿瘤类器官培养基的主要成份表中文名称英文名称基础培养基AdvancedDMEM/F12谷氨酰胺G1.utaMAX4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液HEPES青新素/链霉素penici1.1.in/streptomycinN-乙酰半胱氨酸N-acety1.cysteine尼可酰胺Niacinamide无血清添加剂B27表皮生长因子EGF纤维母细胞生长因子10FGF1.O肝细胞生长因子HGFWnt-3a*Wnt-3a胃泌素IgastrinIWm信号通路激活剂*R-Spondin1.头蛋白*NogginT
2、GF抑制剂A83-01ROCK抑制剂*Y-27632地塞米松（诱导细胞增值）*Dexamethasone牛血清白蛋白BSAMDM2抑制剂p53激活剂*Nut1.in3a*肿瘤培养可选者不加或低浓度使用*分离培养前三天加。*根据肿瘤样本和细胞本身存在的的heterogeneity,样本量足够大时可考虑调整成分，浓度看哪个条件更适合样本的培养。1.2 类器官培养3D支架材料3D基质胶提取自基底膜的基质，主要由层粘连蛋白、IV型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等组成,还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。基质胶在室温条件下聚合形成具有生物学活性的三维支架，模拟体内细胞外基质的结构、组成、物理特性和功能。该结
3、构不仅有利于体外细胞的培养和分化，而且能够为胃肠道上皮细胞的生长提供支架。基质胶在零度以下低温环境呈液态，故凡是涉及基质胶的试验操作皆应置冰盒操作。1.3 组织消化酶肝脏组织消化中涉及的消化的主要有IV型胶原酷(Co1.1.agenaseIV)与DNasek其作用是水解肝脏ECM中的胶原蛋白成分，从而使肝脏细胞从组织中充分分禽出来，以利于制备为单细胞悬液。1.4 类器官冻存液类器官冻存液为无血清冻存液，一般宜含有10%的二甲基亚飒(DMSO)o2肝脏类器官培养操作要点2.1 类器官污染的处置肝脏类器官培养过程中应定期观察、拍照。一般在第2天于倒置显微镜下可以观察到类器官小球，随着培养时间延长，
4、类器官小球逐渐增多、增大。定期观察有利于及时发现污染。如果在培养3天内出现基质胶浑浊，提示可能有霉菌和细菌污染，应及时做丢弃处理。在类器官培养过程中也有可能出现支原体污染。支原体在培养基上呈现团状、小球状生长，容易与类器官混淆，但支原体在显微镜下观察不到上皮的组织细胞结构。若发现可疑支原体污染，可加入支原体去除剂进行挽救，支原体去除剂可以抑制并消除支原体的生长，若仍不能去除支原体污染则做丢弃处理。2.2 类器官培养物接种注意事项将获取的细胞悬液与3D基质胶按照1:1混匀吹打，吹打过程中切忌产生大量气泡，以免影响后续培养物接种。24孔板可提前于37培养箱预热30min,以加速3D基质胶的凝固。2
5、.3 类器官传代注意事项肝脏类器官可以连续传代超过10代或持续培养6个月以上。与类器官有关的试验研究宜在连续传代10代以内或者持续培养6个月内进行。3类器官冻存注意事项冻存前每孔加入5001.的OrganOidharvestingSoIUtiOn,将类器官吸至试管内，按照501.胶加5001.的organoidharvestingso1.ution,置于冰上60min,去除基质胶，离心清洗后，加入ACCU1.aSe消化3-5min,使其消化成单细胞悬液，100OrPm离心5min。弃上清后加入适量类器官冻存液混匀(Im1.左右)，分装于5001.低温冻存管中，放入程序性冻存盒内于-80C深低温
6、冰箱过夜保存，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。4类器官复苏注意事项从液氮罐中取出的类器官冻存管要应快速放入37水浴锅中令其尽快融化。吸出类器官冻存物移至15m1.无菌离心管中，再加入10倍体积的AdVanCedDMEM/F12培养基混匀。之后操作同前述的类器官传代培养过程。附录B（资料性）STR检测首先了解下STR检测流程，先提取细胞DNA,然后进行PCR扩增及测序，最后进行结果分析。详细检测流程请看下图:受检类器官STR位点的基因分型数据与其对应的标准细胞系（其原始组织或衍生细胞系）STR基因分型数据进行比对:1若两者的匹配度N80%,则判定受检细胞系为标准细胞系或为标准细胞系的衍生细胞
7、系。2若两者的匹配度在56%-80%之间，建议结合细胞系形态、细胞系特异性标记物等辅助分析进行综合判断。3若两者的匹配度W56%,则判定受检细胞样本与其对应的标准细胞系不相关。附录C（资料性）染色体核型检测1 .试验当天保证细胞处于对数生长期，一般一个6cm的培养皿80%的密度能做一次试验。2 .将待测细胞从37,5%Co2培养箱中拿出，添加秋水仙素（终浓度为0.2ugm1.）,摇匀后37孵育1-2小时。3 .等待的同时，配制低渗溶液0.075MKC1.（配制:8m1.无菌水+44.7mgKC1.）,放入37C水浴预热。孵育后的细胞用胰酶消化，1200转/分，离心5min,收集于离心管中，去除
8、上清液，用8m1.低渗液重悬，打匀后放37水浴箱40min4 .加入新鲜配制的固定液（甲醇/冰乙酸=2131）2m1.混匀，室温下放IOmin后，IOOO转/分离心Iomin,去上清液（留500u1.,先将底部细胞吹匀），新加入8m1.固定液，1200转/分，离心Iomin,重复三次后，滴片，放入80烘箱老化3小时。5 .再将烤干的玻片放入新鲜配制的胰酶（0.25%）中消化Imin（严格控制时间）后,再放入吉姆萨染液中染色5-10分钟（先用1片染5min,根据颜色调整后面的染色时间），取出用流水冲去染液后，在显微镜下观察结果。附录D（资料性）肝胆肿瘤类器官鉴定1类器官显微镜下状态评估将肝胆肿瘤
9、类器官培养皿置于倒置显微镜下，在20倍视野下计数类器官数目。类器官数目不少于60个/视野表明类器官生长状态良好。生长活力好的类器官平均直径约为160m-200m0若个别类器官体积过大（可达IoOOm）则提示类器官趋向衰老，应尽早传代，以防止衰老的类器官影响类器官传代。2类器官存活率评估2.1 肿瘤组织消化肝脏肿瘤组织酶解后获得单细胞悬液，采用台盼蓝（TryPanb1.Ue）染色进行活细胞计数。将离心后的细胞沉淀用AdVanCedDMEM/F12培养基重悬（约1001）,经吹打均匀后吸取181置于1.5m1.的EP管，向EP（eppendorf）管中加入2u1的0.4%的台盼蓝染液充分混匀，染色
10、3min,取IOg细胞悬液加入血细胞计数板，在倒置显微镜IOX物镜下计数，分别计数四大格中未染成蓝色和染成蓝色的细胞总数。利用如下公式计算每100U1.体积中细胞总数和细胞存活率：总数/100P1=（未染成蓝色细胞数+蓝色细胞数）/4）X103X1.11细胞存活比例=未染成蓝色细胞数/（蓝色细胞数+未染成蓝色细胞数）X100%活细胞比率应90%可用于类器官细胞培养。2.2 类器官传代及冻存复苏类器官传代前、酶解为8-10个细胞的小细胞团后以及类器官复苏后，应用1.IVE/DEAD细胞成像试剂盒测定类器官细胞群中的活细胞（绿色）和死亡细胞（红色）组分，荧光显微镜拍照统计分析存活率。3肿瘤类器官的
11、形态学及免疫标记鉴定肝胆肿瘤组织或者肝胆肿瘤类器官成功构建后，通过制备冰冻切片或者石蜡包埋切片，进行苏木素/伊红染色（H&E）进行形态学鉴定，通过免疫荧光或者免疫组化染色进行生物标志物检测。肝细胞标志物HNF4,干性细胞标志物SoX9、1.GR5、EPCAM等，增殖标志物Ki67、肝细胞标志物HNF4a、成熟肝细胞标志物A1.B和CYP3A4等，肝胆肿瘤标志物AFP,CA19-9,CK-19,CEA,GS,HSP70,TBX3,GPC3,MUC1.I1.-6,IDH1/2等，紧密连接蛋白Zo-1。同时进行类器官整体染色：培养大小约IoO-200Um的类器官，加入OrganoidharVeS1.
12、ingSo1.UIion,置于冰上放置Ih以溶解基质胶，预冷PBS漂洗类器官，低速离心（60OrPm）2次。力口入0.125%TritOnX-IOO破膜液，室温作用IOmin,室温PBS漂洗3次后封闭用血清（10%二抗血清）封闭1.h。将类器官分别放置相应染色组别的共聚焦小室中，10%二抗血清作为配制一抗的稀释液，根据不同稀释比配制一抗抗体组合，滴加一抗，4C孵育过夜后PBS漂洗3次。不同组别分别滴加各种荧光标记的二抗，室温避光作用1.h。PBS漂洗3次后加入DAPI衬核液，室温作用Iomin后PBS漂洗3次。加入水性封片剂，避光湿盒保存，共聚焦显微镜下观察采集图像并三维重建类器官结构。附录E
13、（资料性）类器官的核酸及蛋白质提取1类器官的核酸与蛋白质提取1.1 类器官需要先消化制备为细胞悬液，然后在11,20OXg离心Imin,弃上清，加2001.悬浮细胞缓冲液GA,振荡使细胞彻底悬浮；1.2 加入201.蛋白酶K（ProteinaseK）溶液，混匀；1.3 再加入2001.核酸与蛋白分离缓冲液GB,充分颠倒混匀，70C放置IOmin,溶液应当变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；1.4 加入2001.无水乙醇，充分振荡混匀15sec,此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；1.5 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），13,40OX
14、g离心30sec,倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；1.6 向吸附柱CB3中加入5001.去除蛋白质杂质缓冲液GD（已按照说明加入无水乙醇），13,40OXg离心30sec,倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；1.7 向吸附柱CB3中加入6001.去盐漂洗液PW（已按照说明加入无水乙醇），13,40（）xg离心30sec,倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；1.8 重复操作步骤1.7；1.9 将吸附柱CB3放回收集管中，13,40OXg离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；1.10 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中
15、间部位悬空滴加50-2001.的DNA洗脱缓冲液TE,室温放置2-5min,13,40OXg离心2min,将溶液收集到离心管中。2RNA提取2.1 收集细胞：待类器官长到一定的数量后，将24孔板中的培养基去除，加入Im1.的PBS进行清洗1遍。去除PBS后，加入Im1.的无动物源性重组胰酶，并用Im1.量程的移液枪将基质胶打散，以利于消化醐与类器官进行充分的接触与消化。30min后，将细胞溶液转移至RNaSe-Free的离心管中离心（300g,5min）,收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清；2.2 裂解处理：轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加入适量裂解液R1.（3501.）,旋涡震荡；2.3 将所
16、有溶液转移至过滤柱CS上（过滤柱CS放在收集管中），13,400xg离心2min,收集滤液；2.4 向滤液中加入1倍体积70%乙醇(通常为3501.或6001.),混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱CR3放入收集管中)，13,40OXg离心30-60sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；2.5 向吸附柱CR3中加入3501.去蛋白液RW1.,13,400xg离心30-60sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；2.6 DNaseI工作液的配制：取101.DNaseI储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入701.
17、去除DNA缓冲液RDD,轻柔混匀；2.7 向吸附柱CR3中央加入801.的DNaseI工作液，室温放置15min：2.8 向吸附柱CR3中加入3501.去蛋白液RW1.,13,400xg离心30-60sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；2.9 向吸附柱CR3中加入5001.漂洗液RW(按照说明加入乙静)，室温静置2min,13,400xg离心3060sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；2.10 重复步骤2.9；2.11 离心(13,400xg,2min),倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；2.12 将吸附柱CR
18、3转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30-1001.RNase-FreeddH20室温放置2min,离心(13,400g,2min),得到RNA溶液。3蛋白质提取3.1 收集细胞：待类器官长到一定的数量后，将24孔板中的培养基去除，加入Im1.的PBS进行清洗1遍。去除PBS后，加入Im1.的无动物源性重组胰酶，并用ImI量程的移液枪将基质胶打散，以利于消化酶与类器官进行充分的接触与消化。30min后，将细胞溶液转移至RNaSe-Free的离心管中离心(300g,5min),收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清；3.2 裂解处理：轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加入适量裂解液RIPA(501.71.)及蛋臼醐抑制剂，旋涡震荡,将其转移至EP管中，置于冰上裂解30min;3.3 蛋白收集：离心(4,12,OOOxg,15min),收集上层蛋白溶液；3.4 蛋白定量：使用BCA试剂盒进行蛋白定量；3.5 蛋白变性：加入适量上样缓冲液，金属浴100C,15min,使蛋白变性；3.6 蛋白储存：短期内使用蛋白可置于20C储存，长期储存置于-80C。10
