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1、第三章 生物化学检验常用技术,第一节 光谱分析技术,吸收光谱分析技术发射光谱分析技术散射光谱分析技术,一、吸收光谱分析法,4,光源,单色器,吸收池,检测器,显示器,钨灯、卤钨灯 3501000氢灯、氘灯 180360,滤光片棱镜光栅,玻璃比色皿石英比色皿,5,(一)、分光光度技术的基本原理,1、吸光度与透光度,A=-lgT=-lgI/I0=lgI0/I,当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部分光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即：,T=I/I0,T100%为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即：,6,
2、2、Lambert-Beer定律,Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。,A=KLC,A 为吸光度；K 为比例常数，称为吸光系数；L 为溶液层厚度，称为光径；C 为溶液浓度,Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体,当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，吸光度与溶液层厚度和溶液浓度成正比。,L,Lambert-Beer定律适用于:可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体以及分散均匀的固态或气态样品.,单色光 均匀介质吸收物质无相互作用,3、Lambert-Beer定律的应用条件,4、
3、Lambert-Beer定律的偏离现象,溶液：稀溶液、化学变化光学;非单色光、散射和折射仪器;光源、实验条件,在分光光度法中，为消除显色剂及样品中各种共存有色物质产生的干扰、抵消比色皿和试剂对入射光的影响而用来调节仪器百分透光率为100%的溶液。,5、空白溶液的选择,蒸馏水,试剂,样品,不含待测元素,不显色,1、溶剂空白：不加样品和任何试剂，用纯溶剂（如蒸馏水或其他有机溶剂）作参比溶液。选择原则：当显色剂及其它试剂均无色，被测试样中又无其他有色离子时，选用溶剂参比。,2、试剂空白：用不加样品，而显色剂和其他试剂都相同的溶液作参比溶液。选择原则：当显色剂本身有颜色或其它试剂有颜色，被测试样中又无
4、其他有色离子时，选用试剂参比。,3、样品空白：用不加显色剂的样品溶液作参比溶液。选择原则：当试样溶液有颜色，而试剂、显色剂均无颜色时，选用样品空白。,4、平行操作空白：按样品分析完全相同的操作步骤，用不含待测元素的样品进行平行操作，以消除操作过程中引入干扰杂质所带来的误差。选择原则：当操作过程中由于试剂、器皿、水和气等因素引入了一定量的被测试样组分的干扰离子,5、不显色空白：可将一份试样加入适当的掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂 和其它试剂均按照操作手续加入，以此作为参比溶液，这样可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。选择原则：当显色剂和被测试样均有颜色时，可选用此法。
5、,(二)、分光光度法在生化检验中的应用,灵敏度高、操作简便、应用广泛,1、对未知化合物进行定性分析,2、对待测物质进行定量测定,定性依据：,最大吸收波长max和摩尔吸光系数,标准曲线法和比较法,11,(1).标准曲线法,根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。,方法：,5.标准溶液设置的浓度范围足够大。
6、,13,2比较法,CR=(AR Cs)/As,己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为：,二、发射光谱分析法,处于激发态的待测元素，原子回到基态时以辐射的形式释放出能量，由此而产生的光谱称为发射光谱，对元素进行定性与定量分析的方法。,发射光谱是指样品本身产生的光谱被检测器接收；吸收光谱是光源发射的光谱被样品吸收了一部分，剩下的那部分光谱被检测器接收。,火焰光度法,荧光光度法,火焰光度法是以火焰为激发光源，用光电检测系统测量被测元素所发射的辐射强度来进行定量分析的方法。它是一种简化的发射光谱分
7、析法,（一）、火焰光度法,FP640火焰光度计,火焰光度法分析示意图,火焰光度法的特点,应用范围窄,灵敏,快速,准确,设备简单,试样溶液于数分钟内可完成测定,火焰光源稳定性高，干扰少，误差为25，可用于微量分析和常量分析,分析碱金属与碱土金属，绝对灵敏度可达0110106 g,被测试样易被火焰激发，产生的谱线较简单，且均在可见光区，故使谱线分离和测量的设备简单,主要用于碱金属和部分碱土金属的测定,1、激发条件,影响火焰光度分析的因素,2、试样的种类和组成,3、试液中共存离子对测定有影响,4、仪器的质量,火焰温度要适当，温度过低灵敏度下降，温度太高则碱金属电离严重，影响测量的线性关系。,（二）、
8、荧光分光光度法,化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。,利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。,荧光的定义：,某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的光。,荧光产生的原理：,荧光分光光度法,分析测定蛋白质、核酸、维生素等;对某些激素及其代谢产物的测定;,当化合物含量太少,一般分析方法灵敏度不够时,使用荧光分析技术就能解决测定问题。,三、散射光谱分析法,透射比浊与散射比浊是免疫比浊的常见的两种方法，其反应的原理一样，只是检测的光信号与
9、仪器的检测器有区别。1、透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的周期较长。2、散射比浊的优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。,光的散射,用单色光照射透明溶液时，大部分按原来方向透射，而一小部分则按不同的角度散射开来。,散射光谱分析法,利用悬浮颗粒混浊液的散射光强度或对入射光减弱的原理进行定量分析的方法。,第二节 电化学分析技术,一、电位分析法 ISE,利用电极电位与浓度的关系测定物质含量的电化学分析方法。,电位分析法,一类用特殊敏感膜制成，对溶液中
10、某种特定离子有选择性响应的电化学传感器,离子选择电极 ISE,电解质溶液中参与电化学反应的离子的有效浓度,离子选择性电极的类型和品种很多，外形也差异很大；但基本结构都包括：对特定离子有选择性响应的薄膜(敏感膜或传感膜)、内参比溶液与内参比电极。敏感膜将内侧参比溶液与外侧的待测离子溶液分开，是电极的关键部位。,ISE基本结构,电极电位,电极电位测量,在电位分析中，构成电池的两个电极，其中一个，其电位值随待测离子浓(活)度的变化而变化，能指示待测离子的浓(活)度，称为指示电极，或离子选择性电极。,指示电极,而另一个电极，其电位不受试液组成变化的影响，具有较恒定的数值，只是作为测量电位的标准，称为参
11、比电极(参考电极)。,参比电极,离子选择性电极：电位法测定溶液中某种定离子活度的指示电极；能在多种离子存在的混合液中，选择性地响应该特定离子，指示出这种离子活度变化情况，测定离子的活度或浓度。,选择性好 在多数情况下，共存的离子干扰小，对组成复杂的试样往往不需要分离处理就可直接测定。灵敏度高 电位法的检出限为10-510-8 mol/L，适于微量组分的测定，电位滴定法适于常量分析。快速 仪器设备简单、操作方便、分析快速、测定范围宽、不破坏试液，易于实现分析自动化。缺点 需要有专用的离子选择性电极。,电位分析法的特点：,3、离子选择性电极的分类和主要类型根据国际纯粹及应用化学联合会（IUPAC）
12、的建议，离子选择性电极一般采用如下分类：,根据国际纯粹及应用化学联合会(IUPAC)的建议，离子选择性电极一般采用如下分类：,常用的离子选择电极,玻璃膜电极,气敏电极,如，二氧化碳气敏电极：微孔气体渗透膜憎水但能透气(由醋酸纤维、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯等材料制成)。测定时，CO2气体通过微孔渗透膜与中介溶液接触(中介液是0.001mol/L的NaHCO3)；由于CO2与H2O结合生成碳酸，从而影响到碳酸氢钠的电离平衡。,气敏电极通过界面发生化学反应进行工作的，离子电极用来指示中介液中某一离子活度的变化。溶解在水溶液中的气体，只要能生成可用离子选择性电极检出的离子，均可用气敏电极测定。,用pH玻
13、璃电极间接测定CO2的含量,气敏电极是一种气体传感器，测定溶液中的气体含量。,原理：利用待测气体对某一化学平衡的影响，使平衡中某特定离子的活度发生变化，来测定试液中被测气体的分压(含量)。,在气敏电极的中介溶液中放入玻璃电极。测量时，控制试液的酸碱度，使CO2通过气透膜扩散加入气敏电极；引起中介溶液pH的改变。测定中介溶液的pH值，即可计算出试液中CO2的浓度。,CO2+H2O=HCO3-+H+NH3+H2O=NH4+OH-SO2+H2O=HSO3-+H+2NO2+H2O=NO3-+NO2-+H+H2S+H2O=HS-+H3O+HCN+H2O=H3O+CN-HF+H2O=H3O+F-,凡是溶于
14、水释放H+的反应，都可以用pH玻璃电极检出；而后三种分别可以用S2-、CN-、F-等离子选择性电极来检测。,可用电极测定的气体,酶的催化反应专一强；酶电极有极高的选择性。作为一种生物传感器，酶电极特别适用于生物医学、生物化学等领域。,酶电极,选择适合的指示电极 制成具有催化活性的水不溶性酶膜 把酶膜固定在电极的表面(酶的固定化),酶电极的制作过程,将生物酶涂布在离子选择性电极或其它传感器的敏感膜上，通过酶催化作用，使待测物质产生能在该电极上响应的离子或化合物，间接测定该物质。,脲酶催化分解尿素产生NH3、CO2，溶于水可得到不同产物NH3、CO2、NH4+、HCO3-等，可用相应的离子选择性电
15、极来检测它们，间接得到尿素的含量。,常用的固定化技术有：吸附、试剂交联、共价键合、包埋法(酶与载体聚丙酰胺混合后直接包在电极敏感部分形成酶凝胶层)。,几种酶电极的品种与性能,标准曲线法 标准比较法 标准加入法,离子选择性电极的分析方法,1、直接法：,2、间接法：,样品不经稀释，直接由电极测量离子活度。,样品经缓冲溶液稀释后由电极测量离子活度。,用测定离子的纯物质配制一系列已知活度或浓度的标准溶液，用离子计测定，绘制电极电位与活度对数的关系曲线；然后在相同条件下测定样品，由标准曲线查得浓度。,将已知的小体积标准溶液，加入已知较大体积的待测液中，根据加入前后电位值变化，求得待测液中被测离子得浓度。
16、,二、电导分析法,电导分析法,在外电场作用下，以电解质溶液中正负离子迁移为基础的电化学分析法。,什麽是电导？衡量电解液导电能力的量度值这里所说的电导是指电解质溶液中正、负离子在外电场作用下的迁移而产生的电流传导导电能力与溶液中正负离子的数目、离子所带的电荷量、离子在溶液中迁移的速率等因素有关,利用电解质溶液的电导值来确定物质含量的分析方法,利用溶液的电导与溶液中离子数目的相关性建立分析方法,第三节 干化学分析技术,将液体检测样品直接加到含有试剂的固相载体上发生反应，依照反应结果定量测定样品中特定成分的浓度或活动的一项技术。,干化学分析技术是以酶法为基础的一类分析方法，又有干试剂化学或固相化学之
17、称。,干化学分析,一、干化学分析技术的基本原理,根据多层膜测定方法不同，可将多层膜分为3种类型：,反射光度法,差示电位法,荧光反射光度法,荧光技术竞争免疫技术,反射光度法,漫反射光是指从光源发出的光进入样品内部，经 过多次反射、折射、散射及吸收后返回样品表面的光,朗伯定律描述入射光和吸收光之间的关系,KubelkaMunk 理论描述一束单色光入射到一种既能吸收光，又能反射光的物体上的光学关系。,差示电位法,二、干化学分析技术在临床检验中的应用,反射光度法系统,胶片涂层技术,袋式分析仪,仪器检测:,三、干化学分析技术的影响因素,反射光度计 标准灰色试剂条 离子选择电极干式化学分析仪 标准条,校准
18、频度:,质控物:,干片试剂的储存与使用:,温度和湿度:,第三节 电泳分析技术,带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象,电泳：,电泳技术:利用电泳现象将多组分样品分离、分析的技术,电泳仪:可以实现电泳分离技术的仪器,一、电泳分析技术的基本原理,溶液中粒子的带电状态,两性电离及两性电解质:,等电点时蛋白质分子在电场中不会移动。溶液的pH值离等电点越远，颗粒所带的电荷越多，电泳速度也越快。,等电点pI:,某一溶液中粒子所带的正、负电荷相等，即净电荷为零时溶液的pH值。,电泳迁移率,影响电泳的因素,1、分子的形状和性质,2、电场强度,电场强度大，速度快，产热多，变性；电场强
19、度小，速度慢，产热少，区带模糊,47,3、电泳缓冲溶液,维持电泳介质pH恒定,并起导电作用,溶液的酸碱度决定被分离物质的解离程度和带电性质及所带净电荷量。pH与pI差值越大，粒子带电量越多。,缓冲溶液不能过酸过碱，以免使蛋白质发生变性，pH一般4.5-9.0为宜。,缓冲溶液的离子强度影响缓冲容量、电泳速度和产热效应,兼顾上述效应将缓冲溶液离子强度设置在一个合适的范围，一般设在0.050.1mol/L为宜,4、支持介质,纸的吸附作用最大，醋酸纤维素膜的吸附作用较小。,吸附作用和电渗作用,5、蒸发,二、常用电泳技术及应用,按电泳方式分类,1.移动界面电泳,2.区带电泳,3.稳态电泳,带电分子的移动
20、速率通过观察界面的移动来测定,带电荷的分子在具有渗透能力的介质上的迁移,分子颗粒的电泳迁移在一定时间后达到稳态,按电泳支持物分类,(五)等电聚焦电泳(IEF),第五节 基因扩增技术,在体外将微量的目的基因片段大量扩增，以得到足量的DNA供研究分析和检测鉴定用的技术,聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction（PCR）,一、PCR反应基本原理,含Mg2+的缓冲液,dNTPs,耐热DNA聚合酶Tag DNA聚合酶,特异性引物一对分别与待扩增DNA序列两端互补的寡核苷酸片段。,模板DNA,PCR反应体系,PCR基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,循环2
21、530次,使模板DNA完全变性成单链。同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除,使引物和模板DNA退火结合,此温度下DNA聚合酶以dNTP 为底物催化DNA链的延长,三个步骤为一个循环，每次循环产物作为下一轮模板进入下一轮循环,第一轮循环,引物A,引物B,变性（95）,退火（60）,延伸（72）,DNA-Pol,DNA-Pol,温度,第二轮循环,引物A,引物B,变性（95）,退火（60）,延伸（72）,温度,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,第三次循环,变性（95）,退火（60）,延伸（72）,温度,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Po
22、l,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,第一次循环,第二次循环,第三次循环,第四次循环,一种新的核酸微量分析技术。尤其在定量RT-PCR中具有重要价值。实现了PCR技术从定性到定量的飞跃。,实时PCR的基本原理是：引入荧光标记分子，使PCR反应中产生的荧光信号与PCR产物量成正比，对每一个反应时刻的荧光信号实时分析可以计算PCR产物量。根据动态变化数据可以精确计算样品中原有模板含量。,荧光定量PCR技术,实时PCR技术原理示意图,没有扩增反应时探针保持完整，荧光报告分子和荧光淬灭分子同时存在于探针上，无荧光信号释放。,荧光探针引物,R,Q,Q,R,传统的PCR,实时PCR系统增加了特殊引物作为探针,3端荧光淬灭分子（Quencher，Q）,5端荧光报告分子（Reporter，R）,PCR进行时，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板结合着的荧光探针，其5 3核酸外切酶逐步切断荧光探针探针，荧光报告分子和荧光淬灭分子分离产生荧光信号。荧光信号被检测系统接收用于数据分析。,荧光定量PCR的临床应用,肝炎、禽流感、结核等传染病的诊断；性别发育异常；、珠蛋白生成障碍性贫血、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标记物及癌基因检测与诊断。,谢谢,
