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1、第六章 微生物的生长及控制,第二节 微生物的生长规律,第四节 微生物培养法概论,目录,第一节 测定生长繁殖的方法,第三节 影响微生物生长的主要因素,第五节 有害微生物的控制,第一节 测定生长繁殖的方法,生长(growth)：个体体积或重量的变化繁殖(reproduction)：个体数量的变化个体生长个体繁殖群体生长群体生长个体生长 个体繁殖衡量群体生长的量：生长量，繁殖数,1 纯培养的分离法,稀释平皿法平板划线分离法利用选择培养基分离法单细胞挑取法,纯种分离,稀释倒平板法,划线法,单细胞挑取法,这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养。具体方法是将显微镜挑取器装置在显微镜上
2、，把一滴菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细滴管，在显微镜下对准某一个单独的细胞挑取，再接种到培养基上培养。此法需要非常熟练的操作人员，多限于高度专业化的科学研究中采用。,利用选择培养基分离法,不同微生物需要不同的营养物质。有些微生物生长适于酸性环境，有些则适于碱性环境。各种微生物对不同的化学试剂如消毒剂（酚）、染料（结晶紫等）、抗生素及其他物质等具有不同的抵抗能力。利用这些特性，便可配制成适合于某种微生物生长而限制其他微生物生长的各种选择培养基，以便达到纯种分离的目的。另外，也可以将待分离的样品先进行适当处理，以消除不希望分离到的微生物。对一些生理类型比较特殊的微生物，为了
3、提高分离机率，往往在涂布分离前先进行富集培养，其目的是提供一个特别设计的培养环境，以帮助所需的特殊生理类型的微生物的生长，而不利于其他类型微生物的生长。,微生物纯种分离方法的比较,稀释平板法 既可定性，又可定量，用途广泛平板划线法 方法简便，多用于细菌分离单细胞挑取法 局限于高度专业化的科学研究利用选择培养基法 适用于分离某些生理类型较特殊的微生物,2.1 测定生长量 测体积 称干（湿）重 菌丝长度测定法 比浊法 生理指标法：测含氮量 测含碳量 测磷、DNA、RNA、ATP 商业上测定生长量的方法 生理指标法，电阻抗法，微量量热法，放射法,2 微生物生长的测定-生长量和繁殖数,微生物快速检测设
4、备-奥地利sy-Lab，Bactrac,微生物快速测定（ATP）,比浊法,turbidity,血球计数法（活细胞计数）平板活菌计数法（试剂纸法）菌落形成单位(cfu,colony forming unit）膜过滤法 自动计数法稀释摇管法,微生物生长的测定2.2 测细胞的个数,血球计数法,又被称为Petroff-Hausser counting。,平板活菌计数法,平板活菌计数法的两种策略涂布和倾注,自动计数法,稀释摇管法,丝状微生物菌丝长度的测定,生长曲线 同步生长 连续培养,第二节 微生物的生长规律,细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图,细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量
5、，以培养时间为横坐标，以菌数的对数为纵坐标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。,四个阶段：延滞期(lag phase)对数期(exponential phase)稳定期(stationary phase)衰亡期(decline phase,death phase),1.典型生长曲线(growth curve),生长曲线中各时期的细胞变化情况,延滞期(lag phase),将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。,细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均 长度比刚接种时长6倍。一般来说
6、处于迟缓期的细菌细胞体积最大；细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。,以上特征说明细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓。在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。,迟缓期出现的原因：,微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解或催化有关底物的酶或辅酶，或是缺乏充足的中间代谢物和必需的生长因子，种子老化（即 调整代谢需要一段适应期）,迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。,在生产实践中缩短迟缓期的常用手段,(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短
7、；,(2)利用对数生长期的细胞作为种子；,(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；,(4)适当扩大接种量,对数期(exponential phase),特点生长速率常数最大；代时(generation time)最短；细胞平衡生长；酶系活跃，代谢旺盛。作为发酵生产的良好种子，可缩短延滞期。几个概念生长速率常数(growth rate constant):每小时分裂的代数 R代数代时,稳定期(stationary phase),稳定期到来的原因：营养物比例失调；积累了有害代谢产物；理化条件不适宜。特点：生长速率常数为零；菌体产量达最高点；细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物，芽孢
8、杆菌开始形成芽孢，积累次级代谢产物。,营养物质消耗，代谢产物积累、pH变化逐步不适宜于细菌生长生长速率降低直至零（即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。,生产上延长稳定期的方法：补充营养物质（补料）或取走代谢产物、调节pH、调节温度、对好氧菌增加通气、搅拌或振荡,获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物,与稳定期相关的几个概念,初生代谢物(primary metabolites)次生代谢物(secondary metabolites)稳定期产物(idiolites)菌体生长期(trophophase)代谢产物合成期(idiophase),衰亡期decline phase;death phase,
9、营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。,特点：细菌代谢活性降低；细菌衰老并出现自溶；产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应,如何利用生长曲线指导生产,种龄：利用对数生长期的种子；延长稳定期；确定放罐时间。,采用活菌计数比较麻烦，必需严格操作，否则不易得到准确的结果，重复性也差，在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。,2.同步生长(synchronous growth),同步培养(Synchronous cul
10、ture)：,使群体中的细胞进行同步生长培养技术,群体细胞能处于同一生长阶段，同时进行分裂的生长。,同步生长：,通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物,生理与遗传特性的研究；工业发酵的种子；,同步培养物：一种理想的材料,机械方法,离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法,环境条件控制技术,温度培养基成份控制其他（如光照和黑暗交替培养）,获得同步培养物的手段,同步生长的生长曲线,3.微生物的连续培养,单（分）批培养(batch culture)密闭培养(closed culture)连续培养(continuous culture)开放培养(open culture),将微生物置于一定容积
11、的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。,在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。,连续培养系统恒化器(chemostat),稀释率控制生长速率,连续培养系统恒化器(chemostat),使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。,恒化连续培养中，必需将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，以作为限制性因子，而其他营养物均过量。,限制性因子必须是机体生长所必需的营养物质，如氨基酸和氨等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，因而可在一定浓度范围内能决定该菌体生长密度。,恒化器控制指标：稀释率限制性底物
12、浓度,恒化器作用：1.长时间保持对数期2.模拟自然界经常出现的低浓度底物的状态。3.富集和分离细菌。,恒浊器,恒浊连续培养,测定所培养微生物的光密度值,自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速,使培养物维持在某一恒定浊度,当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；,恒浊器(turbidostat),改变培养基的流速，以控制菌的浓度恒定。微生物在恒浊器中始终以最高的生长速率进行生长。用于获得大量菌体、与菌体生长相平行的代谢产物的生产。,一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业,单级和多级连续培养器,单级连续培养
13、器(one-step continuous fermentor)：代谢产物的生产速率与菌体生长速率平行。多级连续培养器(multi-step continuous fermentor)：代谢产物的生产速率与菌体生长速率不平行。,连续发酵(continuous fermentation),连续培养用于生产实践时，就称为连续发酵。连续培养的优缺点优点：高效、便于自动控制、产品质量稳定。缺点：菌种易退化、易污染杂菌、培养基利用率低。,补料分批发酵,补料分批发酵也叫半连续发酵、半连续培养，流加发酵（fed-batch fermentation），它是以分批培养为基础，间歇或连续地补加新鲜培养基的一种发
14、酵方法。,微生物的高密度培养,进行高密度培养的具体方法很多:选取最佳培养基成分和各成分含量补料(常采用逐量流加方式)提高溶解氧的浓度防止有害代谢产物的生成,第三节 影响微生物生长的主要因素,温度 氧气 pH值,温度生长曲线,不同微生物的温度生长曲线,从左到右：极度嗜冷微生物、嗜冷微生物、嗜温微生物、嗜热微生物、极度嗜热微生物,氧气对微生物生长的影响,按氧气需求划分微生物：专性好氧菌(strict aerobe)兼性厌氧菌(facultative aerobe)微好氧菌(microaerophile)耐氧菌(aerotolerant anaerobe)厌氧菌(anacerobe),Oxygen
15、for growth,微生物对氧的不同耐受能力的解释,好氧生物因为有SOD，因此剧毒的超氧阴离子自由基（O2）被歧化成毒性稍低的H2O2，在过氧化氢酶的作用下，H2O2再变成无毒的H2O。,pH对微生物生长的影响,pH 最适pH 最低pH 最高pH pH的影响机理：影响营养物的离子化程度 影响环境中有毒物质对微生物的毒性 影响代谢反应中各种酶的活性,第四节 微生物培养法概论,(一)固体培养法1.好氧菌的固体培养试管斜面、培养皿琼脂平板及较大型的克氏扁瓶、茄子瓶等进行平板培养。2.厌氧菌的固体培养加入刃天青(resazurin)等氧化还原势指示剂,实验室培养法,用于厌氧菌培养的厌氧手套箱及培养箱
16、,(二)液体培养法,1.好氧菌的液体培养(1)试管液体培养(2)三角瓶浅层液体培养(3)摇瓶培养(4)台式发酵罐2.厌氧菌的液体培养放入专门的厌氧罐或厌氧手套箱中培养,就不必提供额外的培养措施;若单独放在有氧环境下培养,则在培养基中必须加入巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C 或庖肉(牛肉小颗粒)等有机还原剂,二、生产实践中培养微生物的装置,1.好氧菌的曲法培养 原始的曲法培养就是将皮、碎麦或豆饼等固态基质经蒸煮和自然接种后,薄薄地铺在培养容器表面,使微生物既可获得充足的氧气,又有利于散发热量。2.厌氧菌的堆积培养法 如我国的传统白酒生产中,一向采用大型深层地窖对固态发酵料进行堆积式固态发酵。,(一)
17、固态培养法,固体好氧-通风曲,(二)液体培养法,好氧菌的培养浅盘培养深层液体通气培养（发酵罐）,第五节 有害微生物的控制,控制（有害）微生物的生长速率或消灭不需要的微生物，在实际应用中具有重要的意义。,几个基本概念,1、灭菌(sterilization),采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。例如各种高温灭菌措施等。,2、消毒(disinfection),消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。举例：一些常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法；对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理
18、的巴氏消毒法等；,3、防腐(antisepsis),防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。防腐的常用措施低温缺氧干燥高渗高酸度防腐剂,4、化学治疗(chemotherapy),它是利用具有高度选择毒力（selective toxicity，即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂；一些重要的化学治疗剂种类：各种抗生素磺胺类药物中草药中的有效成分等,灭菌、消毒、防腐和化疗的比较,物理杀菌因素的代表温度,利用高温杀菌：焚烧灭菌 干热灭菌
19、 干烤灭菌(160-170,2h)灼烧灭菌 煮沸消毒法 湿热灭菌 高压蒸汽灭菌法 间歇灭菌法 巴斯德消毒法,烘箱内热空气灭菌法,150170 12h 彻底杀灭细菌；适用于金属和玻璃器皿的灭菌；,火焰灼烧法,仅适用于接种环、接种针的灭菌或带病原菌的材料、动物尸体的烧毁等。,干热灭菌法,1、热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强；2、热蒸汽比热空气穿透力更强；3、蒸汽存在潜热，当气体转变成液体时可放出大量热量；4、可迅速提高灭菌物体的温度。,相同温度下，湿热灭菌比干热灭菌好；,湿热灭菌法,干热与湿热空气对不同细胞的致死时间,物理杀菌法射线,辐射灭菌(Radiation Sterilization)是利用电
20、磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。,用于灭菌的电磁波有微波，紫外线(UV)、X-射线和-射线等,由图可见波长为230300nm的紫外线有杀死微生物的能力，但紫外线的穿透能力低，所以仅用于表面消毒和空气的消毒。除紫外线外，也可利用0.06-0.14nm的X射线或由Co60产生的射线进行灭菌。,物理杀菌法过滤除菌法,利用过滤方法阻留微生物，也可达到除菌的目的，这就是过滤除菌法。此法适用于澄清液体和气体的除菌。工业上常用过滤法大量制备无菌空气，供好氧微生物的培养过程使用。对于一些不耐热的物料如氨基酸、维生素等也可以用微滤除菌。,化学杀菌剂或抑菌剂1.表面消毒剂,重金属盐类：红
21、汞有机化合物(酚类、醇类、酸类、醛类)氧化剂：卤素及其化合物，过氧化物表面活性剂：新洁尔灭 肥皂染料：龙胆紫气体：环氧乙烷,常用表面消毒剂及应用,化学物质的抗微生物能力的测定,液体培养法,最低抑制浓度（minimum inhibitory concentration（MIC）实验,平板培养法,抑菌圈（zone of inhibition）试验,六氯酚,苯基苯酚,氯,季铵化合物,在临床上最早使用的消毒剂-石炭酸,2.化学杀菌剂抗代谢药物,抗代谢药物：一类在化学结构上与细胞内必要代谢物的结构相似，并可干扰其正常代谢活动的化学物质。,抗代谢药物的代表磺胺类药物 前身：百浪多息 杜马克：百浪多息治疗感
22、染性溶血链球菌 分离出有效成分：磺胺,-链球菌所引起的疾病：1.肺炎链球菌2.酿脓链球菌,磺胺类药物作用机理,叶酸结构：对氨基苯甲酸(PABA)结构：磺胺结构：核苷酸,磺胺作用机理,酶1 酶2 二氢喋啶 二氢喋酸二氢叶酸 PABA Glu 酶3 前体四氢叶酸 嘌呤嘧啶,磺胺,TMP,酶一：二氢蝶酸合成酶酶二：二氢叶酸合成酶酶三：二氢叶酸还原酶,3.抗生素,抗生素作用机理：抑制细胞壁的形成：青霉素等影响细胞膜的功能：多粘菌素等干扰蛋白质合成：链霉素等阻碍核酸的合成：博莱霉素等,作用于细胞壁的抗生素,抗药性出现,微生物产生抗药性的原因有:产生一种能使药物失去活性的酶；(2)把药物作用的靶位加以修饰和改变；(3)形成“救护途径”；(4)使药物不能透过细胞膜；(5)通过主动外排系统把进入细胞内的药物泵出细胞外,滥用抗生素的后果,筛选新的抗生素；对天然抗生素的结构进行改造；寻找比抗生素疗效更为广泛的生理活性产物；生物药物素：具有多种生理活性的微生物次生代谢物；酶抑制剂免疫调节剂受体拮抗剂抗氧化剂,解决方法,
