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1、原 理,免疫细胞化学(免疫组化)是将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本,并通过对其所带有的特殊标记物的显示,籍以对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。亲和组织化学:则将一些具有双价或多价结合力的物质(生物素),应用于免疫组化,使得抗原抗体的亲和力比免疫组化高出100万倍。其更具高灵敏性和高特异性。,原 理,Bax凋亡相关基因Bcl-2家族成员细胞损伤时其蛋白构象发生改变(寡聚化)作用线粒体膜,使其膜通透性增加,释放Cytc,细胞凋亡,原 理,本次实验以Bax构象蛋白为抗原,用小鼠特异性抗体(一抗)与其结合,再用生物素标记的羊抗小鼠抗体(二抗)与前者结合,形成了生物素复合物。此复合物与S
2、ABC作用,使得检测物被放大,最后在显色剂DAB的作用下,Bax构象蛋白显色(褐色)。,器材与试剂,仪器:移液枪、枪头、滴管、显微镜 材料:培养细胞 试剂:甲醇、PBS、封闭液、一 抗、二抗、SABC、DAB、0.3H2O2-PBS、,试 剂 说 明,PBS:磷酸盐缓冲液(0.01M pH7.4)封闭液:山羊血清(或BSA),用时PBS稀释 一 抗:小鼠IgG,用时PBS稀释 二抗:生物素标记的羊抗小鼠IgG0.3 H2O2-PBS(甲醇)消除内源性过氧化物酶活性作用 SABC(avidin-biotin-peroxidase complex 链酶亲和素 生物素过氧化物酶复合物):抗生物素,起
3、到放大作用 DAB(diaminobenzidine)显色液:3,3-二氨基联苯胺,实验步骤,培养细胞(96孔板,每组3正常、3损伤、3损伤恢复)PBS洗,5min X 3次(轻轻地洗涤)甲醇固定10minPBS洗,5min X 3次加入封闭液(1:10)25l,37,30min加一抗(1:300)25l,37,1h(或4过夜)PBS洗,5min X 3次加二抗(1ml PBS加入生物素化山羊抗小鼠IgG 10l)25l,37,1hPBS洗,5min X 3次,实验步骤,加0.3 H2O2-PBS(甲醇),37,30minPBS洗,5min X 3次SABC工作液(1ml PBS加入SABC
4、10l,混匀)20-30l,37,1hPBS洗,5min X 3次DAB显色:DAB显色工作液配制(现配):1ml蒸馏水,加试剂盒中A、B、C试剂各一滴,混匀后加至细胞孔板,镜下控制,以蒸馏水终止反应。观察结果,实验结果,缺糖前 Hela 细胞,缺糖 24h Hela细胞,缺糖 48h Hela 细胞,缺糖前 PC 12细胞,缺糖 24 h PC 12细胞,缺糖 48 h PC 12细胞,注意事项,一、二抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。染色背景过高,在DAB显色之前,用含0.01-0.02TWEEN20的PBS洗涤标本4次,再PBS洗2次,然后DAB显色。DAB有毒性(小心)SABC试剂盒保存在4 为佳(2年),而-20 短期内生物活性则被破坏。购试剂盒时注意厂家批号,其差异很大,会影响稳定性。,告 知,实验(四)细胞内微核的检测 家系分析,