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1、肿瘤分子流行病学是应用流行病学方法研究肿瘤标志物在高危人群和癌症患者中的分布和影响因素，对机体致癌物质暴露、生物学效应以及个体遗传易感性进行测量和评价。肿瘤分子流行病学作为肿瘤流行病学的重要分支，为肿瘤研究提供了新的重要手段和契机，大大增强了应用流行病学方法开展肿瘤危险性评价、筛查和诊治手段选择、预后评估、预防策略制定的能力。随着蛋白质组学等新兴学科的加入，肿瘤分子流行病学正在成为肿瘤学研究领域的重要研究手段之一。,一、概述,肿瘤分子流行病学采用流行病学研究方法，结合分子生物学等新兴学科的理论和技术平台，通过对有代表性人群从接触危险因素、癌前病变发展到肿瘤形成过程中一系列肿瘤标志物的研究，可以
2、准确地测量“暴露”、生物学效应和遗传易感性，探讨肿瘤发生的机制。1982年，Perera、Weinstein提出“molecular cancer epidemiology”。,一、概述,肿瘤标志物是连接实验室检测和传统流行病学研究的桥梁，通过对研究对象特定生物学标志物的定性或定量检测，可以评估致癌物暴露和机体遗传易感性的单独或联合作用。Bence-Jones蛋白是第一个被报道的肿瘤标志物（1845）。按照肿瘤标志物在从暴露到疾病连续过程中所处的不同阶段可以分为暴露标志、效应标志和易感性标志。,二、肿瘤标志物的研究与应用原则,质量控制原则 要重视肿瘤标志物的效度（灵敏度和特异度）和信度，保证肿
3、瘤标志物真实反映暴露和疾病之间的统计学关联。要注重样品采集、贮存、处理等操作过程的标准化。不同实验室之间可以有相互监测，用严格的质量控制系统来实现对肿瘤标志物价值的持续评估。,二、肿瘤标志物的研究与应用原则,循证医学原则 肿瘤分子流行病学对肿瘤标志物的研究应做到最佳证据、经验和研究对象意愿的最佳结合，用“最佳质量证据”来指导肿瘤标志物的研究和应用。肿瘤标志物开发和评估的五阶段原则(NCI)：第一，探索阶段;第二，临床试验和验证阶段;第三，回顾性/前瞻性的研究阶段;第四，前瞻性的筛查阶段;第五，前瞻性的随机试验阶段。,二、肿瘤标志物的研究与应用原则,伦理学原则 上世纪80年代后期，美国学者Bea
4、uchamp和Childress提出了生物医学研究的四个伦理学原则：自主性、有益、无害、公平。1997年，联合国教科文组织针对人类基因组和人权的全球宣言中特别强调了伦理学因素的重要性。在收集遗传信息和建立大型数据库时，要取得社会和研究对象对其研究目的和计划的知情同意，切实保护每个捐献者的个人利益。,三、致癌物的暴露标志,外暴露标志：移民流行病学的多项研究结果均揭示了环境因素在肿瘤的发生、发展过程中的重要性。传统意义上对外环境的调查或监测只能对外暴露做出粗略的估计，难以真实反映人体的反应性，且存在较大的回忆偏倚和报告偏倚。,三、致癌物的暴露标志,内暴露标志：充分考虑了致癌物质在吸收、分布、代谢或
5、排泄上的个体差异，并显示出其在机体特定的组织或器官中的实际水平。如膳食营养状况与肿瘤间关系的研究（高脂与大肠癌）；EB病毒、Hp与胃癌（淋巴上皮瘤样癌）关系研究。,三、致癌物的暴露标志,生物有效暴露标志：这一类标志物主要是以DNA加成物或蛋白质加成物的形式存在。在相同外暴露的前提下，样品中加成物的水平可以反映研究对象代谢致癌物的能力以及吸收和分布的个体差异，能够帮助确定体内致癌物代谢及DNA修复过程中各种酶基因多态性的影响。常用的加成物测定方法有：酶联免疫吸附试验，32P后标记技术，质谱、色谱分析等。,三、致癌物的暴露标志,生物有效暴露标志：DNA加成物：苯并（a）芘-DNA加成物是人类发现的
6、第一个致癌物质的DNA加成物。DNA加成物与肿瘤关系研究最成熟的应该是AFTB1-N-鸟嘌吟加成物与肝癌发病关系的研究。乙烯基DNA加成物是脂质过氧化诱导DNA损伤的标志物。,实例：O6-烷基-2脱氧鸟嘌呤加成物（O6-MedG）,70年代初，美国学者发现O6-MedG，并建立了单抗及放免技术。1985年，中科院利用这项技术进行了林县食管癌流行病学调查，找到了亚硝胺病因学说的证据。1986年，陆士新等学者完成了一项食管癌的病例对照研究和实验性研究。国外学者随后发现，O6-MedG的修复缺陷或受限可诱发点突变，使原癌基因激活而发生食管癌。,三、致癌物的暴露标志,生物有效暴露标志：蛋白质加成物：多
7、为致癌物及其衍生物与血红蛋白或白蛋白共价结合而形成。如：4ABPHb加成物与膀胱癌之间关系密切。,四、致癌物的效应标志,效应标志物主要反映机体接触了致癌物质之后所发生的多步骤的癌变过程中的某些事件。现有的效应标志物主要是基因毒性标志物，包括DNA缺失、点突变、DNA单链断裂、染色体异常、癌基因激活等。,四、致癌物的效应标志,染色体异常（CA）：CA是人群中应用最广泛的早期生物学效应标志物。CA与肿瘤发生密切相关：1.染色体重组在原癌基因活化和抑癌基因失活中起到重要作用；2.所有类型的肿瘤细胞中都存在真核核型的改变；3.化学性致癌物常常引起染色单体异常；4.暴露于电离辐射可以导致双着丝粒等；5.
8、某些先天性疾病有很高的CA率，且恶性肿瘤的发病率增加。6.队列研究显示CA发生率与全肿瘤发病率相关。,实例：食管癌（吴玉清等，1986）,食管癌高发与低发家族中，染色体畸变率分别为5.4%和0.38%。经亚硝胺化合物MMC诱发的染色体畸变率分别为10.8%和4.2%。常见的断裂或缺失多发生在1、2、3、11和17号染色体的某几个特定部位。MMC诱发的SCE也显示病例组明显高于对照组。,四、致癌物的效应标志,微核（M N）：无着丝粒染色体片段聚集或整个染色体在复制后期的移动期间被滞留。表征染色体的畸变，是对传统的CA分析的重要改进，能够检测非整倍体，而且更易实施。可作为肿瘤的预测标志物。,微核,
9、四、致癌物的效应标志,次黄嘌吟鸟嘌吟磷酸核糖转移酶(HGPRT)：HGPRT基因体细胞突变的检测是人群研究中最早进行的体细胞突变检测。HGPRT参与肿瘤细胞DNA生物合成替代途径。Wang等在江苏启东肝癌高发区的研究发现，AFTB1高暴露者HGPRT突变的频率要高出19.3倍，说明HGPRT基因的突变频率可以作为AFTB1暴露所致长期后果的效应标志物。,四、致癌物的效应标志,现代分子生物学认为：遗传信息和表观遗传信息共同调控生物信息的表达。研究表明：每种肿瘤至少有一种基因的启动子区发生超甲基化；很多基因启动子超甲基化具有肿瘤类型的特异性。CpG岛甲基化在胃癌等多种肿瘤中有报道。,五、肿瘤发生的
10、易感性标志,许多遗传性家族性肿瘤综合征都有基因的高外显率突变。在探讨致癌机制的过程中，总有该因素会“选择”让一部分人逐步走向癌变，这在考虑暴露因素施加给宿主的不同免疫压力的同时，更应该关注宿主遗传易感性对癌变过程的影响。,五、肿瘤发生的易感性标志,（一）代谢酶及其基因多态性：代谢酶有I相和II相之分。I相酶主要是细胞色素氧化酶P450家族(CYPs)，它们催化氧化反应，引入亲电子基团，使致癌物活化。II相酶则引入亲水基团，使致癌物代谢排出，如谷胱甘肽S转移酶(GSTs),N-乙酰基转移酶(NATs)、葡萄糖醛酸结合反应转移酶(UGTs）等。代谢酶基因的多态性可以改变相应酶的活化或解毒的能力，从
11、而增加或降低环境暴露因素的致癌潜能。,CYPs家族：,具有最高催化活性的是CYP1A1和CYP2A2，参与多环芳烃代谢，与吸烟相关的上呼吸道、上消化道、泌尿道和乳腺的肿瘤有关。CYP2E可以催化外源性N-亚硝胺，其多态性与胃癌发生风险有关。CYP2A6*2等位基因的479T A 突变的产物具有较低激活前致癌物的能力，因而对机体有保护作用。CYPs也可能在雌激素的代谢中起到一定作用，因而与乳腺癌的癌变过程有关。,GSTs家族：,主要有四种：GSTA、GSTM、GSTT、GSTP。其中由于T1、M1、M3在人群中存在纯合缺失而最常被研究。GSTM1基因发生纯合突变而不能正常表达者，可导致多种类型肿
12、瘤的发生风险增大。GSTM1还参与抗肿瘤物质如异硫氰酸酯的排泄。但也有研究表明CSTM1纯合突变型人群表现为低的肿瘤患病率，还有研究并未发现该基因多态与肿瘤发生风险的关系。,NATs家族：,主要代谢动物蛋白在高温下产生的杂环胺和多环芳烃。NAT2的慢乙酰化者(S/S基因型)膀胱癌的发病风险增大，尤其是对接触杂环胺和多环芳烃职业的人。在吸烟类型和吸烟量一致的前提下，慢乙酰化基因型者4-ABP-Hb加成物的水平远高于快乙酰化者。与在膀胱癌发生中的保护作用相反，快乙酞化者结肠癌的发病风险增大。,UGTs家族：,低水平的UGT酶活性可能意味着更严重的氧化损伤和肿瘤发生风险的增加。有报道停经前美国黑人妇
13、女中，有变异UGT基因型的乳腺癌的发病风险约增加1.8倍。,其它：,亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFR)：MTHFR可能在调节与膳食摄入有关的胃癌风险方面起作用。MTHFR基因677C T和1298A C的纯合型都会降低酶活性，与较低的血叶酸水平有关，携带有MTHFR 677T的个体，胃癌尤其是贲门癌的发病危险增加。超氧化物歧化酶(SOD)：相对较高的SOD水平是保护宿主胃黏膜免受高浓度的毒性ROMs损伤的防御屏障;而较低的SOD水平使得胃黏膜易受氧化应激损伤，导致肿瘤形成，也是患者临床预后较差的重要标志。儿茶酚氧位甲基转移酶(COMT)：能够灭活儿茶酚，减少其与DNA结合并诱导损伤，COMT基
14、因型和乳腺癌的关系随停经状态、体格大小和吸烟状况而不同，表明其在乳腺癌中的作用可能要依赖于激素环境。,五、肿瘤发生的易感性标志,（二）DNA修复相关基因多态性：DNA修复是牵涉一系列机制的复杂过程，其相关基因多态性导致的DNA修复效率与保真度的差异与个体肿瘤发病风险之间有密切关系。X射线交错互补修复基因1(XRCC1)：影响细胞对电离辐射敏感性，它通过与聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶、DNA连接酶III和DNA多聚酶R等作用，在DNA损伤单链断裂修复中起重要作用，与口腔癌、食管癌、膀胱癌以及乳腺癌的发生有关。O6甲基鸟嘌吟DNA甲基转移酶(MGMT)：可将突变或细胞毒性的加成物从O6甲基鸟嘌吟转移到
15、自身的半胱氨酸残基上，修复烷基化损伤。MGMT基因的突变(或多态性)可能会增加个体对烷化剂的易感性。,五、肿瘤发生的易感性标志,（三）炎症因子的基因多态性：免疫系统的反应对于肿瘤预防是十分有益的，强大的机体免疫力有助于个体灭活肿瘤细胞，包括人类白细胞抗原基因、白介素基因、肿瘤坏死因子基因、环氧化酶基因等炎症反应相关基因的多态性都与肿瘤发生密切相关。波兰的研究发现IL-1B-511CT或IL-1-RN短等位基因纯合型均导致胃癌的发生风险增大。葡萄牙学者的研究也表明同时有IL-1B-511T和IL-1RN*2/*2基因型者患胃癌的风险增大。中国和日本针对胃癌高危人群的研究表明，亚洲居民与欧美人不同
16、，该基因的多态可能并不与胃癌有关，但是IL-1B-511C在未感染Hp人群中可能意味着较大的胃黏膜萎缩风险。,六、蛋白质组学在肿瘤分子流行病学中的应用,蛋白质组学主要依靠生物化学手段对细胞所有蛋白质或蛋白质组进行大规模研究，研究蛋白显微特征、差异显示和蛋白-蛋白交互作用。蛋白质要比基因更接近功能，对蛋白质的研究通常可以直接导致生物学发现或假说，将极大地促进后基因组时代对于基因功能的理解。,六、蛋白质组学在肿瘤分子流行病学中的应用,肿瘤分子流行病学可以借助蛋白质组学技术的强大力量，找到更为敏感和特异的肿瘤标志物。蛋白质组学技术可以在蛋白质水平研究基因功能，能够提供大量的蛋白蛋白交互作用的资料，为
17、生命科学做出重要和直接的贡献。蛋白质组学技术通过确认与肿瘤发生相关的基因表达谱，从而阐明导致肿瘤表型的分子机制，以选择最适合某一肿瘤类型的治疗方案。,六、蛋白质组学在肿瘤分子流行病学中的应用,双向凝胶电泳配合质谱分析乳腺浸润性导管癌蛋白质组的变化，发现25种表达量显著不同的、28种不同功能的蛋白质，可作为肿瘤治疗或诊断的候选标志。用芯片技术已经识别骨桥蛋白是卵巢癌的一种可能的标志物。美国公司开发了一种卵巢癌筛查的蛋白质组学方法，通过识别关键蛋白的分布来鉴别卵巢癌，具有较高的灵敏度和特异度。有学者通过直接组织蛋白质组学技术，可以直接从福尔马林固定石蜡包埋的前列腺肿瘤组织样品来发现蛋白质，研究者发
18、现428种前列腺表达的蛋白质，并可在pg数量级上检测PSA。,六、蛋白质组学在肿瘤分子流行病学中的应用,由于蛋白质的行为由二级结构决定，对依靠亲和力来捕获靶蛋白的技术体系造成了很大限制。运用质谱对确切的化学成分不能常规鉴别，需要有附加的蛋白质富集和鉴别程序才能识别潜在的肿瘤标志。质谱分析还存在峰高和丰度之间的关系并非线性、难以实现重复、需要蛋白质指纹图谱数据库为依据等困难。蛋白质组学研究还未开发出类似于PCR的扩增体系，给检验低丰度蛋白质带来一些困难。,七、肿瘤分子流行病学存在的问题,对肿瘤分子流行病学研究的评估必须建立在对研究设计和分析进行严格考核的基础上。由于偏倚和混杂因素的控制不当，不仅
19、导致无价值的结论，甚至违背科学精神。流行病学判断因果关联的一个重要标准是关联的合理性。肿瘤分子流行病学常常孤立地研究某种标志物的重要性，这种研究的片面性已经越来越突出。肿瘤分子流行病学还需要生物学、化学、基础医学、计算机科学等多学科交叉发展，从而开发出兼具灵敏性、特异性、精确性的肿瘤标志物和更灵敏、更快速、高通量、自动化的检测工具，用于肿瘤的预防、诊断和治疗。,八、前瞻性肿瘤分子流行病学实例,确定某种标志物是否能够作为某疾病早期标志只能通过前瞻性的队列研究和实验性研究来证实。由于前瞻性研究人财物消耗巨大，更重要的是缺少合适的标志物，导致目前前瞻性的研究依然较少。,实例一：美国国家癌症研究所(N
20、CI),乳腺癌、前列腺癌以及激素相关基因多态性队列联合研究。融合了美国肿瘤协会的肿瘤预防研究队列II、哈佛队列研究、国际癌症研究机构的欧洲癌症与营养前瞻性调查研究、夏威夷和南加州大学的多种族队列研究以及NCI的前列腺癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌肿瘤筛查试验和生育酚-胡萝卜素研究的资料和生物样品。共研究了6160例乳腺癌和8850例前列腺癌患者发病过程中53个候选基因突变(或多态性)的影响以及与环境的交互作用。经过协调的资料融合可以保证不同研究间基因型的标准化而确保基因突变研究的可比性。,实例二：国际癌症研究机构(IARC),CA和肿瘤风险的队列研究。共有来自克罗地亚、匈牙利、立陶宛、波兰和斯洛文
21、尼亚的6430名健康人，随访从1978年到2002年。研究表明：高、中CA水平与低CA水平相比，RR分别为1.81、1.78，这种关联在胃癌发病中表现最强。该研究进一步明确了CA与肿瘤发生风险之间的关系。,实例三：芬兰 Maattanen等,评估血清PSA在前列腺肿瘤筛查中的特异度的随机对照试验。共对32000人进行筛检。结果：PSA=4.0ug/L或者PSA在3.03.9之间同时辅助试验(直肠指诊)阴性定为筛查阴性。第一轮筛查的特异度达0.933(95%CI=0.929-0.936)。总体而言，芬兰PSA筛查试验的特异性较好。,实例四：北京大学临床肿瘤学院,通过根除Hp预防胃癌的人群干预试验。山东临朐胃癌高发现场，1994年Hp抗体检测阳性的3365人随机进入了阿莫西林+奥美拉唑、微量营养素补充剂(维生素C、维生素E、硒)、大蒜制剂的2X2X2析因设计(2258人)与维生素补充剂和大蒜制剂的2X2析因设计(1107人)。结果发现，胃癌及其癌前病变的发病风险显著降低，而且对于胃癌前病变的进展或转归以及平均的组织病理学严重性的改善都有显著的效果。,Bye bye,
