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1、辅助生殖实验室技术操作规范第一章.精液检查及精子制备第一节、精液常规检查操作方法实验者收到取精杯后应首先核对取精杯上姓名、编号是否与精液送检单符合，同时核对精液送检单上是否漏填重要信息，确认无误后方可接收。操作技术将在原按WHO第四版实验指导手册的基础上过渡，逐步以WHO第五版实验指导手册（WHe）1.aboratorymanua1.fortheExaminationandProcessingofhumansemen,fifthedition）所规定的方法实施精液常规检查，并以其规定格式出检验报告。同一份精液标本若有多个检查项目，按各项目要求分别做标本处理和检验。（一）初步检验：1 .液化后精
2、液检查前应认真记录：精液检查通知单所提供的全部信息2 .观察记录：精液量、颜色、粘稠度、Ph值及液化时间3 .取液化精液10微升滴于洁净载玻片上，用盖玻片覆盖后静止片刻4 .置生物显微镜下观察精液大致状况并记录镜下所见：圆细胞数（生殖道上皮细胞、生精细胞及白细胞）、红细胞数和凝集团块等,并以个/HP表示。(二)操作方法：1 .取液化后精液10微升，滴于MACRO计数板中央计数池内，加盖；2 .置生物显微镜下观察精子浓度及活力。具体方法如下：分别计数10个小格内前向精子(PR)、非前向精子(NP)及不动精子(IM)的数目，PR+NP+IM之和即为精子密度(X1.O6m1.),精子活力分别以PR精
3、子、PR+NP精子占总精子数的百分比表示，计算方法为：PR/(PR+NP+IM)100%,(PR+NP)/(PR+NP+IM)100%o附精子活力分级标准：PR：前向运动精子，不考虑速度NP：各种形式的非前向运动精子IM：不动精子(三)检验后处理1 .以清水冲洗MACRO计数板并用酒精棉签擦拭；2 .以酒精纱布擦拭显微镜台面及实验台面；3 .一次性实验物品丢弃于指定地点；4 .剩余标本按规定进行污物处理第二节、精子形态分析操作方法1.取液化后精液20微升，滴于载玻片一端(上方约1/3处)；2 .用另一张载玻片置于滴有精液处与其形成30度角，均匀拉开液滴（详见WHO实验手册），室温干燥；3 .将
4、干燥后的载玻片置于95%酒精中固定15分钟，取出室温干燥后行巴氏染色；4 .100倍油镜下行精子形态学分析，计数100200条精子。结果描述：参阅WHO实验手册正常形态率%异常形态率%（分别记录：头、体、尾及混合畸形率）第三节、精子低渗肿胀试验（HOS）（一）配制低渗肿胀液溶0.735g枸椽酸钠Na3C6H5O72H2O和1.351g果糖于IOOmI蒸储水中。将该溶液分装于-20度冻存。用前解冻并充分混匀。（二）实验方法1 .取Im1.肿胀液于一只加盖的Eppendorf管中，37度温热约5分钟。加入0.1m1.液化精液，并用吸管轻轻吹打混匀。2 .在37度下至少保持30分钟（注意：不要超过1
5、20分钟）,相差显微镜下观察精子细胞。3 .计数200条精子，计算发生肿胀的精子所占百分比。精子尾部形状发生变化的定义为精子肿胀。（三）结果描述肿胀精子所占百分比可以代表存活精子的比例。（四）注意事项1 .某些精液标本在置于HOS溶液前即有尾部卷曲的精子，因此要在放置于HOS溶液前观察射出精液。处理后获得的尾部卷曲精子的百分比减去未处理标本中尾部卷曲精子的百分比，即可以得到HOS试验中出现反应的精子的实际百分比。2 .在临床使用前.，应当用老批号的HOS溶液对新批号的HOS溶液进行校验，二者不应有显著性差异（配对t检验P0.05）o如果差异显著应废弃该批试剂，重新配制。第四节、全自动精子分析系
6、统使用说明（西班牙SCA全自动精液质量分析系统）全自动精子分析系统可自动探测精子运动轨迹，按WHO实验手册内CASA各项参数指标，计数精子活率、活力、密度、直线运动速率等。系统由电脑软件和显微镜两部分组成。操作方法如下：（一） 初步检验：参见精液常规检查操作方法相关部分。（二） 自动分析：1 .开启电脑-CASA分析软件一建立新档案（键入患者信息）2 .取液化精液10微升滴于精子计数板中央计数池内，加盖玻片一置相差显微镜下（IoX）调节视野至图像清晰3 .点击密度活动力分析一进入分析界面一分析一保存结果（如果需要，可以做人工校正）一报告单（预览或打印）一退出分析系统4 .报告部分内容记录于精液
7、分析登记本上，年终存档保留。（三）分析后处理：参见精液常规检查操作方法相关部分。第五节、抗精子抗体（MAR）检测方法（一）原理：本试验以人IgG敏化绵羊红细胞，用人IgG制备羊抗人IgG血清，采用MAR法检测标本中IgG类抗精子抗体。试剂由A液、B液和C液组成。（二）步骤：1 .取液化精液10微升滴于载玻片上，加入A液10微升混匀，放置15秒；2 .加入B液10微升混匀，覆以盖玻片。分别在3分钟和10分钟后于生物显微镜（40X）或相差镜下镜检，观察运动精子表面是否黏附有敏化的红细胞（SRBC）。（三）结果判定：1 .精子表面无AsAb,可见精子在粘附的SRBC间自由泳动，敏化SRBC间的凝集说
8、明试剂可靠。2 .精子表面有AsAb存在，则敏化SRBC粘附于精子上并一同扭动。在强阳性情况下，凝集块极为巨大，精子只在敏化SRBC形成的凝块中扭动。3 .至少计数IOO条活动精子，计算粘附有SRBC的活动精子在总活动精子中所占的百分比。4 .阳性率R=（粘附SRBC的活动精子数/计数总活动精子数）100%R10%,判定为阴性;R10%,阳性；R240%,判定为强阳性。（四）注意事项：1 .试剂需室温平衡后使用；2 .A液使用前应充分混匀；3 .液化不良精液可用C液洗涤后检测；4 .标本中活动精子密度高时，应适当增加活动精子计数的数目。第六节、细针附睾/睾丸穿刺取精术及精子制备常规（一）操作步
9、骤：1 .准备IOmI和5m1.及Im1.注射器各1支，2%利多卡因5-IOmIo将5m1.2%利多卡因注射在阴囊部精索内，封闭精索神经。2 .术者用左手固定附睾，选择无血管区以Im1.注射器在睾丸表面及阴囊皮肤内注入0.5m1.2%利多卡因作局部麻醉后，以IOmI注射器直接经皮刺入附睾或睾丸后，边持续负压抽吸边退出，利用负压抽出附睾内精子或睾丸内曲细精管，取下放入含培养液的培养皿中间凹内，立即转交实验室处理。3 .压迫穿刺点至无出血，垫一块纱布于内裤里，患者即可下床行走，嘱其2小时不做剧烈运动。（二）实验室处理：1 .将培养皿内的曲细精管用两支Im1.注射针挑动，翻转洗涤12次；2 .将曲细
10、精管叠加切割（撕碎），使精子及其组织细胞游离于培养液中；3 .用于临床诊断可立即镜检（20X）观察有无精子，活动否，通知临床医生；4 .用于临床治疗（ICSI）,混悬液吸入离心管中，静置培养箱孵育30-60分钟，直到用前反复吹打混匀，再静置数分钟，待大块组织沉淀后将上层液体离心（1500转,10分钟）后使用。第七节、伊红试验（一）准备试剂用9g1.氯化钠水溶液配制5g1.的伊红Y溶液。（二）试验方法1 .将一滴新鲜精液与一滴伊红溶液在载玻片上混匀，并覆以盖玻片。30秒后在400倍光学显微镜下观察。2 .计数200条精子，并区分活精子与死精子。活精子不着色（白色），死精子被染成红色。（三）结果描
11、述计数条活精子数条（%）死精子数条（%）第二章.宫腔内人工授精的实验室处理第一节、取精取精前一般禁欲5-7天，过长或过短的禁欲时间均有碍精子的质量，但对于精液差的病例可适当延长禁欲时间。取精时间安排在IU1.前1-2个小时，取精在专用取精室中进行，室内配有双人床或三人沙发，每日紫外线消毒、擦台面。病人在取精过程中须保持取精室周围环境安静，以免造成精神紧张引起取精困难。若发生取精困难可以性交方式取精；有些男性不习惯医院环境可在家取精并在半小时之内将精液送至医院，运送过程中应注意精液保温。取精前患者丈夫先排尿冲洗下尿道，清洗双手，将已写上姓名及病史号的取精杯交患者丈夫并做如下交待：取精杯已消毒，勿
12、污染杯内壁，精液射入取精杯后应立即将杯盖旋紧尽快送实验室处理。实验室收到取精杯后应记录收到时间、核对姓名。逆行射精的取精方法：逆行射精主要表现为患者性交过程中有射精感，但没有精液射出。若膀胱颈在将要射精时未能关闭，射出的精子可能会逆行进入膀胱中，性交后在尿液中发现精子则可确诊。对于逆行射精患者需要特殊处理，取精前口服碳酸氢钠4克5-7天以碱化尿液，有利于保持尿液中精子的活动力。不可服用咖啡及饮料,可以服茶水，服水的目的是使尿液的渗透压降低，若有条件测量尿液的渗透压，在尿液渗透压达到280-320之间时取精最好，取精前测量尿液的PH值，应在6.8-7.4之间。逆行射精的患者需要特殊的容器来收集精
13、液，手淫前排尿，不必完全排空膀胱，如果手淫中有精液射出应收集于容器中，手淫后立即排尿或导尿将尿液收集在另一个容器中。尿液样本必须马上处理，因为即使在服用了重碳酸盐之后尿液仍是酸性的，几乎会立即杀死精子。一旦样本送到实验室，马上测量及记录尿液的体积及PH值。尿液样本必须要充分混匀，因为死精子会下沉到容器的底部。所有的精子，即使是不动的精子，都需要计数。将一滴尿液样本滴在载玻片上进行计数，如果精液数量足够多，还应滴一滴精液样本在Maker板上进行分析。对浓缩后的尿液及可能获得的精液，采用密度梯度离心处理，尿液样本以150Og离心IOmin。然后用新鲜的培养液重新悬浮沉淀。离心时，正常射出的精液(如
14、果有的话)也应进行分析。从尿液中取得的沉淀也应该在载玻片上或者Maker板上分析其密度、活力以及形态。第二节、精液处理1.试剂J：1)精子洗涤培养基：用于精液洗涤和培养的试剂很多，但有二点是共同的，第一，均含有人体蛋白，如白蛋白或血清；第二，均含有葡萄糖。这两个成分是精子体外获能所必需的。用于精液洗涤的培养基按其所含的缓冲剂不同分为两大类，一类是以碳酸氢钠做为缓冲剂，需在5%的二氧化碳气体中保持PH值在7.4左右，但在空气中很快变碱；另一类培养基含有低浓度碳酸氢钠及高浓度的HEPES,这类试剂在空气中PH变化很缓慢，可长时间保持PH在7.4左右，但在5%二氧化碳环境中PH值变酸。以上两类培养基
15、均可用于精子洗涤，但有研究表明用含HEPES的培养基处理精子能更好地保护精子的功能，IUI妊娠率更高。目前精子洗涤培养基已商品化，有些出厂时已添加人体白蛋白(HSA),有些需自己添加蛋白或血清。培养基可以是简单的平衡盐溶液如人输卵管液(HTF)、Ear1.es液(EBSS)、Tyrode,s液(T6)等，有些精子培养基配方很复杂，如HamsF10o2）梯度离心试剂：目前用于梯度离心试剂很多，本中心使用的ISoiate在出厂时渗透压、PH值及梯度已调好并做过严格的生殖毒性检测，用前只需预温，现开现用。2.仪器及耗材1）仪器：离心机（水平式）、干热培养箱、恒温试管架、电动加样器、超净工作台、冰箱、
16、试管架、显微镜、精子计数板。2）耗材：15m1.尖底离心管、14m1.圆底离心管、IOmI刻度量管、9英寸无菌巴士德管、人工授精管（TomCat）、Im1.B-D注射器、5m1.全塑料B-D注射器、酒精灯、硅胶接头、载玻片、盖玻片。3）精液冷冻保存设备及试剂、耗材：液氮、液氮罐、精液冷冻试剂、冷冻管等。3 .处理前准备1）取精前临床工作人员应通知实验室有关人员预温处理精液所需的试剂及试管，打开超净工作台并准备仪器。2）精液取出后应尽快放35-37C恒温培养箱中保温，每5-10分钟摇动几下促使精液液化。3）正常精液在30分钟内液化，若超过30分钟仍不液化应使用带针头的全塑料注射器反复抽吸精液直至
17、精液液化。4）若精液中琼脂样颗粒多应将精液倒入试管中垂直静置一定时间待琼脂样颗粒沉入管底后吸取上层液体处理。5）精浆中含有受精抑制成分，应尽早将精子从精浆中分离，精液一旦液化应尽快处理，处理前取少许精液做常规检查测量精子浓度、成活率及运动率，并根据检查结果选择处理方式。6）实验室工作人员在收到精液杯后应仔细核对杯上的姓名和病史号，凡接触精液的各种试管、巴士德管均需清楚标记，接触过病人体液的试剂不得再用于其他病人。精液中可能含有致病微生物，处理时工作人员应戴一次性手套、口罩、帽子，处理精液后用75%的酒精或10%双氧水擦洗台面，超净工台应定期消毒和细菌培养。4 .精液处理方法1）调恒温箱：温度设
18、定为35度2）试剂2so1.ate、SSS、HTF-Hepes3）处理步骤：精液取出后置恒温箱液化，同时将试剂及试管放恒温台预热待精液液化后取少量精液计数，如果前向运动精子总量少于二百万不可用梯度离心，应使用离心洗涤法。取一支15毫升尖底离心管，先加1毫升IsoIateUP,后加1毫升ISO1.ateDoWN,再加精液，200g离心20分钟去上清,沉淀+Im1.5%sssHTF-HePeS（不能碰壁）混匀200g离心5分钟（或IOOg离心10分钟）重复洗涤两次去上清,沉淀加0.3-0.5m1.5%SSSHTF-Hepes混匀取少量精子悬液计数B.上游法适应症基本同上，但是精液粘度高或不液化则不
19、适宜用上游法，一般上游法的回收效率比非连续梯度离心要低。1）方法一：精子经两次洗涤后，弃上清，沉淀留管底，小心沿管壁加入5%SSSHTF-HEPES1.mI倾斜45度置37度恒温箱45分钟，2）方法二：将精液标本置试管底部，小心沿管壁加入含5%SSSHTF-HEPES1.5m1.倾斜45度置37度培养箱孵育45分钟，收集云雾状上层培养液，经两次洗涤后沉淀用0.5m1.洗精液悬浮做授精用。C.两次洗涤法适用于前向运动精子总数低于200万的病人，冷冻精液人工授精一般也用两次洗涤法。一份精液加一份洗精液稀释，200g离心5分钟，沉淀加Im1.洗精液悬浮，离心洗涤两次后沉淀加0.3-0.4m1.洗精液
20、悬浮做授精用。第三节、授精人工授精前阴道超声扫描看有无排卵。人工授精不需阴道消毒，但用无菌生理盐水纱布擦洗阴道和颈管。将TOMCAT管预先做适当的弯曲，接上Im1.B.D.注射器,并将注射器活塞推到底,核对精子无误后将精子悬液吸入到授精管和注射器中。将授精管宫颈管轻轻插入到宫腔中，缓缓将精子悬液注入宫腔，轻轻退出授精管和窥阴器。授精后患者平卧一刻钟。离院前向病人交代若有恶心、呕吐、腹痛、严重腹胀、体重明显增加等卵巢过度刺激症状应立即复诊。第四节、文件书写IUI前签定“夫精宫腔内人工授精知情同意书”。按“不孕症检查常规”书写病历及作辅助检查，促排卵或超排卵过程记录在“治疗单二”中，精液处理和授精
21、过程记录在“宫腔内人工授精记录单”中。若妊娠将妊娠过程记录在“妊娠结局记录单”中。第三章.体外受精胚胎移植常规第一节、仪器准备（最迟提前2天）胚胎实验室风机、空调24小时不间断运行，室温控制在24度（2度左右）。取卵手术室、ET室使用结束后关闭风机和空调，用前半小时打开。C02培养箱：每日开箱前观测箱温（水银精密温度计）每周一次使用C02测定仪监测培养箱的C02浓度，记录并同时记录箱温每周换水擦洗一次，并作记录胚胎操作箱：每日观测箱温，并作记录每周一次使用C02测定仪监测操作箱的C02浓度，记录并同时记录箱温对异常变动要先报告实验室负责人，再由负责人根据观测情况进行调动，并在24小时内观测其是
22、否恢复正常每日加水，每周一下班前清洁一次。第二节、试剂1 .HTF和U-IVF:分装于大、小试管，（HTF分装Iom1./大试管用于拣卵预培，U-IVF分装Im1./小试管用于处理后精子培养用预培），提前一天置于CO2培养箱平衡。用途:大试管液体用于洗卵,配授精盘（一般井皿每孔装卵不超过8个,根据卵的多少配1-2个盘）；小试管液体用于精子培养。2 .ECM+10%SSS:9m1.ECM+1.m1.SSS,提前一天置于C02培养箱平衡用途:用于制备分裂期胚胎培养皿。3 .MB+10%SSS:9m1.MB+1.m1.SSS,提前一天置于C02培养箱平衡用途：制备囊胚期胚胎培养皿。4 .如果用CSC
23、培养基，则不需2.和3.培养基：CSC+10%SSS:9m1.MB+1.m1.SSS,提前一天置于CO2培养箱平衡。用途：制备从受精卵至囊胚期的胚胎培养皿。5 .冲针液:f1.ushingmedium至少提前1天37C预温用途:用于冲洗卵泡。6 .Iso1.ate:用途:处理精液，用前配制，先批量分装ImI1.ow液于多个尖底离心管，再在各1.ow面上轻轻加上Up液Im1.备用。7 .HTF-HEPES+10%SSS:9m1.HTF-HEPES+1.m1.SSS,分装于2个试管中(5m1.试管)，密闭，放4度冰箱备用。用途：用于精子洗涤，ICSI皿配盘。用量：每个病人5m1.o第三节、所需物品
24、巴斯德管,直径为IOOmm的大平皿,35mm的小平皿，井皿,大试管,小试管,1m1.注射器,吸头,各种接头,刻度离心管,毛细巴斯德管,试管架，煤气喷灯,镜子，电动加样器,纱布,取精杯，精液点样滤纸等第四节、步骤1 .提前一天：配制洗卵授精液、胚胎培养液、精子洗涤液等试剂，并将洗卵授精液、胚胎培养液置C02培养箱中平衡过夜，精子洗涤液密闭置4度冰箱保存，冲针液置37预温。授精盘配置方法：在超净台下按无菌操作要求将授精液(HTF)2m1.加入井皿外围,将HTF1.Om1.加入井皿中央，外围用于洗卵，中央用于授精。注意：受精盘的底座与盖均应用记号笔注明病人姓名及ART号。2 .DayO:取卵当天:（
25、即注射HCG后36h）（1）开通二氧化碳气体，待气体浓度显示稳定后可测定培养箱中二氧化碳浓度，并检查胚胎操作箱温度，作相应校正。（2） .根据当天取卵例数，预温相应井皿、大平皿，并准备相应量纱布、Im1.注射器。（3） .取卵前准备一支巴斯德管，从培养箱取出洗卵液,将洗卵液放置于已预温的井皿中配制洗卵盘，井皿外围加液2m1.,中央加液Im1.o找卵过程中将找出的卵放于井皿外围进行清洗，应注意将血细胞清洗干净，必要时用Im1.注射器切除污染的血块、血斑及黄素化的颗粒细胞，捡卵结束时将已清洗干净的卵冠丘复合体成批放于井皿中央培养。.取卵结束后丈夫取精，精液（精液杯已标明病人姓名）置35恒温箱液化，
26、液化后尽快处理精液。若精液取出半小时后仍不液化，使用2m1.全塑料注射器反复抽吸精液促使液化。取精前开始预温Iso1.ate、精子洗涤液、2支15m1.尖底离心管（室温）。精液处理方法：准备两支巴斯德管（标明病人姓名）,涂片镜检精液情况,根据精子的密度和活力适用不同每层厚度的梯度离心方法（如0.3m1.,0.5m）1.m1.,一般用Im1.）。取一支如前批量准备的Iso1.ate液管,标注病人信息，加入2m1.精液（.加入精液量依精子浓度、活力而定，一般为2m1.注射液及石蜡油。2）由于注射盘液滴很小，为减少液体挥发，作注射盘时动作应迅速，事先应准备好所需的各种物品及试剂，液滴作好后应迅速加石
27、蜡油完全覆盖。3）本中心用35mm培养皿盖作注射盘，液滴形状、大小及分布如nE。C。下图，液滴分布应在直径25mm的区域：说明：1-11号液滴为注射液，直径2-3mm,每滴放卵1-2个12号液滴为PVP13号液滴为注射液，放置精子14号液滴为注射液，用于洗卵，面积约5*10mm2由于注射盘深度约5mm,因此各液滴厚度应低于2mm注射盘作好后，将卵转移到14号液滴中，清洗后将成熟的卵母细胞转移到1-11号液滴中，每滴1-2个卵。自12号液滴右下角将精子悬液缓缓加入其中，加入量视精子浓度而定，但沉淀扩散的范围不超过液滴转折处。6 .准备注射系统1）将作好的注射盘置于倒置显微镜载物台上，下调注射针及
28、持卵针直至接近石蜡油的表面。2）移动视野至14号液滴，将石蜡油注入持卵针中至管尖，然后将持卵针下降到14号液滴中，吸入约5毫米液体，再将注射针升高到石蜡油表面以上。3）移动视野到PVP液滴,将石蜡油注入到注射针中至管尖,注射针下降到PVP液滴中，吸入少许PVP到注射针内，待针内压力平衡后即可开始显微注射。7 .卵细胞浆内精子注射1）移动注射针至13号液滴左侧边缘，将形态正常的活动精子吸入到注射针内，移动注射针至PVP液滴将精子排入其中。2）用注射针针尖压住精子尾部，将注射针迅速划过精子尾部使精子制动。精子制动的目的是破坏精子尾部的细胞膜而使其激活卵子,有利于受精。3）将注射针针尖对准已制动精子
29、的尾端缓缓将精子吸入到注射针内。每次可吸入1-2条精子，注射1-2枚卵子，2条精子之间的距离一般超过三个精子的长度。4）将注射针移到1-11号液滴中，下降持卵针将待注射的M期卵母细胞轻轻吸住，用注射针转动卵母细胞将极体放在6点或12点处，然后将卵母细胞吸紧。调节显微镜焦点对卵母细胞赤道部聚焦，调节注射针位置使注射针与卵母细胞赤道部在同一个平面，将注射针轻轻按压于卵母细胞上证实卵母细胞与注射针在同一个平面后将最前端的一个精子轻轻推至针然后将注射针刺入卵母细胞内,刺入深度约为卵母细胞直径的三分之二，在精子排出前先回吸胞浆直至胞浆在针管内快速流动时立即将精子连同吸出的胞浆注入到卵母细胞内，一旦精子头
30、部进入胞浆即可将注射针轻轻退出到卵母细胞外。回吸胞浆的目的是为了破坏细胞膜保证精子注入到细胞浆内。注入精子时流入胞浆内的PVP量应尽可能的少。5）将固定在持卵针上的卵母细胞轻轻松开再固定另一个待注射的卵母细胞重复以上步骤直至所有的M1.1.期卵子均被注射。6）注射完毕后将已注射的卵母细胞转移到生长液滴清洗3次后按每滴1枚卵子进行培养。7）注射后12-20小时检查是否受精，一般受精后48小时进行全胚胎冷冻或新鲜胚胎移植。第五章.卵子辅助激活常规一、卵子辅助激活指征既往ICSI不受精或者受精率低的患者。二、激活试剂配制购置西格玛的ionomycin粉剂Img,使用DMSO溶解后，分装于1.5m1.EP管，每支EP管分装10,每管含ionomycin0.01mo1.,置于-20C冰箱保存。注意分装保存时将液体拍打至管底，方便使用时精确取液。三、步骤准备井皿、200I移液器、1000I移液器、毛细巴氏德管、U-IVF（ECMMB亦可）、分装后的激活试剂ionomycino1）使用1000UI移液器，在井皿中央加入990PIU-
