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1、临床微生物检验流程示意,临床标本,留取,环节一,运送,实验室,环节二,分析前,分析中,标本合格？,环节三,接种,培养,检测,门诊病房,不合格,合格,环节四,环节五,分析后,报告,环节六,SOP,EQC,IQC,培养基、冰箱温箱、气体,直接检测,仪器设备、试剂,EQA标本,标本合格判定,SOP,对每个环节进行控制，构成质量保证体系,+,失误的不同分布分析前阶段约占总失误的55%，分析阶段约占总失误的4%，分析后阶段约占总失误的41%。,4%,41%,55%,标本质量的好坏直接影响诊断结果的正误，因此在标本采集、送检、保存等各个环节都要规范操作，严格控制，是确保实验结果准确可靠的前提。,标本采集的
2、一般原则：1.早期采集：采集时间最好是病程早期、急性期或症状典型时，而且必须在使用抗生素或其他抗菌药物之前采集。,2.无菌采集：采集的标本应无外源性污染。在采集血液、脑脊液、胸腔积液、关节液等无菌标本时，应注意对局部及周围皮肤的消毒，严格进行无菌操作；对于与外界相通的腔道，如窦道标本应由窦道底部取活组织检查，而不应从窦道口取标本，以免受皮肤表面正常菌群的污染，造成混淆和误诊；,采集的标本均应盛于无菌容器内，盛标本的容器须先经高压灭菌、煮沸、干热等物理方法灭菌，或用一次性无菌容器，而不能用消毒剂或酸类处理。,3.根据目的菌的特性用不同的方法采集：厌氧菌、需氧或兼性厌氧菌，以及L型菌采用的方法不同
3、。如尿液标本，疑为厌氧菌感染时，应以无菌注射器从耻骨上缘行膀胱穿刺术抽取；若怀疑是需氧或兼性厌氧菌的感染，可通过自然导尿获取标本。,4.采集适量标本：采集量不应过少，而且要有代表性，同时有些标本还要注意在不同时间采集不同部位标本。如伤寒副伤寒患者，发病的第1周应采集血液，第2周应采集粪便和尿液，否则影响细菌检出率。,5.安全采集：采集标本时不仅要防止皮肤和黏膜正常菌群对标本的污染，同时也要注意安全，防止传播和自身感染。,一 上呼吸道标本,标本采集方法：嘱患者先用清水漱口，由检查者将其舌外拉使悬雍垂尽可能向外牵引,用压舌板将舌向下向外压，用无菌棉拭子越过舌根到咽后壁或悬雍垂的后侧,反复擦拭数次然
4、后送检，拭子应避免触及舌、口腔粘膜和唾液。,标本采集注意事项：1 采集时间：应于抗生素应用之前。时间上可无严格限制，但咽部是呼吸和食物的通路，应晨起后采集为佳。2 送检：应立即送检。,二 下呼吸道标本,标本质量,脓痰,粘液样痰,唾液or诱导痰(?),血痰,用革兰氏染色来评估 呼吸道标本是否合格,痰标本10鳞状上皮细胞/每低倍视野=拒收,白细胞25个/每低倍视野，鳞状上皮细胞10个/低倍视野为合格标本,标本采集方法1 自然咳痰法：晨痰为佳，用温开水漱口数次（为减少口腔正常菌群污染标本），深咳呼吸道深部痰（非后鼻部分泌物、非唾液）留于无菌容器内。对于痰量少或无痰的患者可采用雾化吸入4510Nacl
5、水溶液，使痰液易于排出。,2 支气管镜采集法：用支气管镜在肺内病灶附近用导管吸引或用支气管刷直接取。3 胃内采痰法：无自觉症状的肺结核病人尤其婴幼儿不会咳嗽，有时将痰误咽入胃中，可采集胃内容物做结核分支杆菌培养。,4 气管穿刺法：主要用于厌氧菌培养5 小儿取痰法：用弯压舌板向后压舌，将拭子伸入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上送检。幼儿可用手指轻叩胸骨柄上方，以诱发咳痰。,注意事项：1 晨痰为好。多数病人清晨痰较多，易于采集，且清晨痰含有的病理成分较多，会增加培养的阳性率。2 有1/4-1/2肺部感染患者可能发生菌血症，应同时作血培养。3 在抗菌药物应用之前采集标本。,
6、4、标本采集后应2小时内送检，否则可暂存于4冰箱，最长不超过24小时（但是肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛氧菌不喜低温，怀疑其感染者切勿冷藏）。痰培养连续3-4次有意义，每次间隔大于24小时。支气管镜纤刷物和肺泡灌洗液取出后及时送检。,三 尿液标本,标本的采集方法：1 清洁中段尿标本，晨尿为佳，嘱咐患者睡前少饮水，保证与上次排尿时间间隔4小时以上。女性采样前用清水冲洗外阴部及尿道口，男性须翻转包皮冲洗，用清水冲洗尿道口，然后收集标本，方法是排尿弃去前段尿，无中断尿流时收集10ml中段尿于无菌容器内送检。于2小时内送检。,该方法简单、易行，是最常用的尿培养标本收集方法，但很容易受到会阴部细菌污染，应
7、由医护人员采集或在医护人员指导下由患者正确留取。,2 耻骨上膀胱穿刺：使用无菌注射器直接从耻骨上经皮穿入膀胱吸取尿液，是评估膀胱内细菌感染的“金标准”方法，但有一定的痛苦，病人难以接受。主要用于厌氧菌培养或留取标本困难的婴儿尿标本的采集。,3 直接导尿：按常规方法对会阴部进行清洗消毒后，用导尿管直接经尿道插入膀胱，获取膀胱尿液。可减少尿液标本的污染，准确地反映膀胱感染情况，但有可能将下尿道的细菌引入膀胱，导致继发感染，一般不提倡使用。,4 小儿收集包：对于无控制能力的小儿可应用收集包收集尿液，这种装置由于很难避免会阴部菌群污染产生假阳性，所以只有在检验结果为阴性时才有意义。如果检验结果为阳性，
8、应结合临床进行分析，必要时可使用耻骨上膀胱穿刺或导尿法留取尿液进行复查。,5 留置导尿管收集尿液：利用留置导尿管采集标本时，应先消毒导尿管外部，按无菌操作方法用注射器穿刺导尿管吸取尿液，操作时应防止混入消毒剂，不能从收集袋中采集尿液。长期留置导尿管患者，应在更换新尿管时留取尿标本。,6 集尿法：尿查抗酸杆菌时，留24小时尿液盛于洁净容器内，取其沉渣10mL送检。,标本采集注意事项：1 通常取清晨第一次尿液送检。2 多数药物均通过尿液排泄，因此，无论用何种方法采集尿液均宜在用药之前进行细菌培养。3 尿培养不得加防腐剂或消毒剂。,4 标本采集后应2小时内送检，不能送检的4 保存，最长不超过6小时。
9、当培养出的细菌革兰阴性杆菌105/ml、革兰阳性球菌104/ml、真菌103/ml时有意义，有3种或者3种以上生长时可怀疑污染。如病人有发热伴随症状可同时做血培养。,四 大便标本,标本的采集方法1 自然排便采集法：自然排便后，挑取有脓血、粘液部位的粪便2-3g，液状粪便取絮状物1-3ml盛于无菌的容器中送检。,2 直肠拭子法：适于排便困难者或婴幼儿。可用肥皂水将肛门周围洗净，用无菌盐水、保存液或增菌液湿润的无菌棉拭子插入肛门,成人约4-5cm，儿童约2-3cm，与直肠粘膜表面接触，轻轻转动,放灭菌试管内送检。,标本采集注意事项1 采集时间：应在急性期采样，以提高检出率，最好在用药前。2 送检：
10、要采集新鲜标本立即送检。,五 血液标本,关于血培养指征只有在发热时，才需要进行血培养。,想采就采,？,怀疑患者有血流感染的症状有：不明原因的发烧(38)或体温过低(36)白细胞增多（10000/ul）粒细胞减少（1000/ul）严重的局部感染(脑膜炎，心内膜炎，肺炎，肾盂肾炎，腹部术后感染等)休克、寒颤、僵直、心率异常加快、低血压或高血压、呼吸频率加快等。,关于采血时机,何时采血进行血培养，无特殊时间要求。,？,细菌浓度,体温,血培养采血时机,时间(分钟),0,30,60,关于采血套数及部位,为减轻患者痛苦，只从一个穿刺部位采一份血液标本即可。,？,基本注意事项：成人“一套”血培养应该包括需氧
11、瓶和厌氧瓶各一个，也叫“一份”注意：一次穿刺采血，算“一套”，采集第二套应从另一个穿刺点获得。儿童一般只做需氧培养，但仍需从多个部位采集多次。特殊患者才考虑厌氧培养。,采血套数,污染菌,致病菌,？,23套血培养，有助于污染的判断。,采集1套无法判断是病原菌还是污染菌。,关于采血量,每瓶采集多少血液无特殊要求,？,采血量(ml)与检出率的关系,血培养物每增加一毫升，真性菌血症成年人微生物的检出率增加3,但并非越多越好，超过一定数量的采血量会稀释培养瓶内的肉汤，使肉汤无法有效中和血中的抑制物质（补体、抗体、抗生素）。所以血液与肉汤的最佳比例为1：51：10,标本的采集方法防止皮肤寄生菌或环境微生物
12、引起的污染是血培养的关键问题，采血前严格执行消毒程序是十分重要的。,1 皮肤消毒程序：严格按以下三步法进行：(1)70%酒精擦拭静脉穿刺部位30s 以上。(2)用碘酊或聚维酮碘（碘伏）棉签消毒皮肤，1-2碘酊作用30s 或聚维酮碘作用60s，从穿刺点向外画圈消毒，至消毒区域直径达3cm以上。(3)70酒精脱碘。对碘过敏的病人只能用70%酒精消毒，消毒60s，待穿刺部位酒精挥发干燥后穿刺采血。,2 培养瓶消毒程序(1)用70酒精消毒血培养瓶橡皮塞子。(2)酒精作用60s。(3)在血液注入血培养瓶之前，用无菌纱布或棉签清除橡皮塞子表面剩余的酒精，然后注入血液。,3 培养瓶接种程序抽取血液后，不要换
13、针头，直接注入血培养瓶中，轻轻颠倒混匀，以防血液凝固。如果同时作需氧和厌氧培养，应先将标本接种到厌氧瓶中，然后再注入需氧瓶，防止将空气注入厌氧瓶中。,标本采集注意事项1 血培养采集的时间和频率(1)采血培养应尽量在抗菌药物使用之前，在24h 内采集2-3 份血培养（一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视为单份血培养），每次2 瓶。研究已证实，2-3 份血培养足以检测所有的菌血症和真菌血症。,(2)入院前2周内接受抗菌药物治疗的患者，可连续3 天采集，每天采集2 份，(3)对间歇性寒战或发热的患者，应在寒战或体温高峰到来之前0.5h采集血液，或于寒战或发热后1h 采集，因为发热时血液中可能没有细菌。
14、,(4)可疑为急性原发性菌血症、真菌血症、脑膜炎、骨髓炎、关节炎或肺炎的患者，应在不同部位采集2-3 份血培养。(5)不明原因发热，如隐性脓肿、伤寒热和波浪热，先采集2-3 份血标本，24-36h 后估计体温升高之前，再采集2份以上。,(6)可疑为菌血症或真菌血症，但血培养持续阴性，应改变血培养方法，选择其它种类的培养瓶，如高渗培养瓶，中和抗生素培养瓶，结核菌培养瓶等，以获得罕见的或苛氧的微生物。,(7)可疑为细菌性心内膜炎者，在1-2h 内多部位采集3 份血标本，如果24h阴性，再采取3 份以上的血标本。,2 采血量成人：推荐每个血培养瓶应加的血量为5-10ml，血液和肉汤比为1：5-10（
15、体积：体积）。骨髓采量一般为1-2ml。儿童：因很难获得大量的血液，一般静脉采血3-5ml 用于血培养。,标本的保存接种标本后应立即送检，如不能立即送检，室温保存，但不能超过12小时。切勿冷藏，因为某些苛氧菌可在冰箱温度中死亡，而使培养阳性率下降。在运往实验室的途中如果天气寒冷，应采取一定的保温措施。,六 脑脊液,标本的采集方法 用腰穿的方法采集脑脊液，如果用于检测细菌或病毒，脑脊液量应大于或等于 1ml，如果用于检测真菌或抗酸杆菌，脑脊液量应大于或等于 2ml。标本采集容器 为无菌试管或小瓶。,标本采集注意事项1 采集时间：应立即采集，且最好于抗生素使用之前。2 送检：穿刺过程中要严格无菌操
16、作，防止污染。收集标本后，常温下 15 分钟内送到实验室。如不能可在25-37度保存，保存时间应小于2小时，绝不可冷藏。如只做培养可直接注入血培养瓶内，及时送检。,脑脊液标本不可放冰箱保存，否则会使一些细菌漏检（如脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和嗜血杆菌）。标本运送过程中必须保证其安全，防止溢出，避免细菌污染。,七 胸腹水 胆汁 心包液 关节液 鞘膜积液 穿刺液,标本的采集方法 1 首先用 2%碘酊消毒穿刺要通过的皮肤。2 用针穿刺法或外科手术引流法采集标本，然后放入无菌试管或小瓶内。为防止凝固，应在试管中先加入灭菌肝素。3 尽可能采取更多的液体，至少为 1ml。,标本采集注意事项 1 采集时间：怀
17、疑感染存在，应尽早采集，一般在患者使用抗菌药物之前或停止用药后 1-2 日采集。2 送检：应在常温下 15 分钟内送到实验室，在常温下可保存 24 小时。如果做真菌培养，只能放 4保存。,3 如怀疑厌氧菌感染则保证不被正常菌群污染，并尽量避免接触空气，用针筒抽取抽出后排出一滴标本于酒精棉球上，然后用橡皮塞封住针头，及时送检。,八 生殖道标本,应根据感染的部位和可能的病原体决定用于病原学诊断的标本种类、采集部位和采集方法等。由于正常菌群的存在，所以在采集标本时应注意尽量减少和避免正常菌群的污染。,1.生殖器溃疡标本：用无菌盐水清洗溃疡面并用无菌手术刀清除坏死组织和覆盖的分泌物，暴露出溃疡基底；待
18、渗出物积聚较明显时，轻压溃疡基地并用拭子或吸管采集渗出物；疑有肉芽肿荚膜杆菌感染时可在溃疡边缘取肉芽肿组织标本。,2.宫颈标本：用无菌生理盐水湿润窥阴器（不用润滑油）暴露宫颈；用拭子清除阴道和宫颈局部分泌物，弃拭子；轻压宫颈以使宫颈分泌物流出，用拭子采集分泌物或用专用拭子插入宫颈内口1-2cm，旋转数周后停留20s，以充分吸附分泌物，拔出拭子，注意不要将拭子接触阴道壁。,3.阴道标本：先用拭子清除阴道表面分泌物，弃拭子；在后穹窿或阴道上端用无菌拭子或吸管采集黏膜分泌物；B群链球菌筛查培养应在阴道口（和/或直肠肛门部位）采集拭子标本。,4.子宫内膜标本：用无菌生理盐水湿润窥阴器（不用润滑油）；用
19、拭子清除阴道和宫颈局部分泌物，弃拭子；用双腔的真空吸引器吸取标本或用拭子取子宫内膜标本，注意防止宫颈和阴道正常菌群的污染。,5.腹腔炎性渗出物标本：通过后穹隆穿刺术获得；亦可直接在手术过程中获得。6.前庭大腺标本：用碘伏等无刺激性消毒液消毒皮肤，急性感染用拭子采取腺管分泌物；脓肿形成时，用注射器吸取脓液。,7.尿道分泌物：标本采集应最少在病人排尿1h后进行，先用无菌拭子清除尿道口分泌物，用另一无菌拭子采集尿道分泌物，分泌物过少时女性可经阴道按摩尿道，男性可从阴茎的腹面向龟头方向按摩，使分泌物溢出。如不能获得尿道分泌物，可将尿道拭子插入尿道约2cm左右，轻轻转动后取出。,8.前列腺液：被检者前1
20、周内停服抗生素，外阴消毒后，留取排出的首段尿液10ml为第一份标本，继续排尿200ml后，留取10ml尿液为第二份标本，即行前列腺按摩，收集按摩液为前列腺液，随之立即排尿，收集首段尿液10ml为第三份标本。4份标本均送细菌培养、菌落计数和药敏试验。,9.淋球菌培养标本应立即送检或床旁接种，勿放冰箱保存。淋病奈瑟菌感染如能同时采集直肠标本会增加阳性率，其采集方法为将拭子插入肛管2.5cm左右，穿过肛门括约肌后转动拭子，停留10-30s，取出的粪便标本不能受到污染。如有尿道症状时可采集尿道分泌物。,10.支原体：男性：用细的无菌棉拭子沾取无菌盐水少许深入尿道口内2.5-3cm。女性：用无菌拭子抹去
21、宫颈口粘液，然后用新的拭子插入宫颈管l-2cm旋转取材。支原体培养取分泌物时，持拭子用力擦下尽可能多的细胞。尚可用前列腺液、精液、尿液离心沉淀物作标本。支原体对干、热抵抗力差，标本采集后应尽快接种支原体运送培养基送检。,九 分泌物标本,1.眼分泌物采集：先用无菌生理盐水冲洗眼部，然后用棉拭子拭干，再用无菌棉拭子采集分泌物。2.耳、鼻咽分泌物采集：直接用拭子在病灶部位擦拭数次，切勿接触周围粘膜或皮肤。,3.伤口、创口、开放性感染、溃破的化脓灶：感染部位与外界相通，先用无菌生理盐水冲洗其表面分泌物和杂菌，然后用灭菌棉拭子擦取病灶深部新生组织边缘的分泌物。,4.脓肿：抽吸前用无菌生理盐水冲去表面分泌
22、物，以避免污染。闭合性脓肿抽吸脓肿壁，开放性伤口尽量抽吸深部脓液送检。深部脓肿常由包括厌氧菌在内的混合细菌感染所致，应同时作厌氧菌培养。,5 烧伤标本：以无菌棉拭子直接采取多个部位创面的脓汁分泌物放入无菌试管中及时送检。,十 静脉导管标本,静脉导管的微生物学培养主要用于检测血流感染是否与导管相关。导管相关性血流感染（CABSI）的定义为：患者在留置导管期间或者拔除导管48小时内发生的原发性，且与其他部位存在的感染无关的血流感染。,导管相关性血流感染的诊断标准：参照美国感染病协会、疾病控制中心 发布的血管内导管相关感染处理指南(1)具有血管内导管的患者；(2)具有明确的临床感染表现，如发热、寒战
23、；(3)不具有其他明确的感染灶；(4)外周血细菌或真菌培养至少1次(+)；,(5)从导管片段和血标本分离出同一病原微生物，包括以下几种情况之一：导管远端部分半定量培养15个菌落或定量培100个菌落；从中心静脉导管得到血标本细菌定量外周静脉血标本5倍；从中心静脉导管得到血标本定性培养呈(+)时间较外周静脉血标本早2h以上。,1、采集方法（1）常规导管部位皮肤消毒。（2）无菌方法从病人体内拔出静脉导管，剪下导管尖端5cm，放入无菌瓶中。（3）立即（15min内）送检，避免标本干燥。,2、接种方法（1）半定量培养法：用无菌镊子将5cm导管在血琼脂平板上来回滚动,然后在二氧化碳孵箱35c过夜培养后如血
24、琼脂平皿上生长15个菌落，提示有潜在导管相关性感染。,（2）定量培养法：将导管放入无菌杯中，抽吸1ml无菌盐水反复冲洗,吸出0.1ml涂布接种，次日菌落数10即为计数结果。菌落计数100个菌落即可判断为导管相关性血流感染。,3、导管尖端结合血培养结果的分析,4、注意事项（1）剪下的导管立即接种血平皿，可提高阳性率。（2）肉汤反复冲洗导管腔内，冲洗液做定量培养。（3）剪下的导管置不能接种于肉汤增菌液或培养瓶中，因为此法不能区分导管感染菌与少量定植菌。,5、防治措施立即拔管是最有效的治疗措施。拔管就能使一部分感染治愈，其余病例在拔管后使用的抗菌药物恰当,则感染也可得到有效控制。换部位重新置管只能作为不得已情况下的权宜之计。因为血流中的病原容易挂在新插入的管头上，并在纤维蛋白鞘的保护下逃避机体免疫系统及抗菌药物的攻击，经过一段时间的生长繁殖就不断向血流中释放病菌，成为新的感染源。,十一 引流液,采集方法：用75%酒精消毒引流管采集部分，然后用注射器从引流管中采集2-3ml，及时送检。注意事项：尽量避免使用棉签采集，以免棉签吸附有效成分；标本不能从引流袋中直接放出，因为引流液在引流袋中潴留时间过长容易滋生杂菌。,正确的微生物学标本的采集，是准确的病原学诊断的前提。谢谢,
