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1、(2015福建卷，33，10分)33.【生物-现代生物科技专题】（10分）GDNF是一种神经营养因子。对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答：,（1）在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是。（2）构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的 限制酶进行酶切。（3）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图1所示）。为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI
2、酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第 泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。（4）将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的 与提取的蛋白质杂交。当培养的神经干细胞达到一定的密度时，需进行 培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。,使细胞分散开,Xho,抗体,传代,细胞工程,1、概念:,植物细胞工程动物细胞工程微生物工程,所采用技术的理论基础,植物细胞工程,通常采用的技术手段,植物组织培养,植物体细胞杂交,植物细胞的全能性,一、植物细胞工程,(离体的植物器官、组织或细胞),脱分化,再分化,培养条件
3、：,离体、含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适合的光照等,外植体,举例：,花药离体培养；基因工程培育的抗棉铃虫的棉花植株；细胞工程中培育的“番茄-马铃薯”杂种植株等。,1、植物组织培养,扩大培养,几个概念：,愈伤组织：离体的植物器官、组织或细胞，在培养一段时间以后，通过细胞分裂，形成一种高度液泡化、无定形状态薄壁细胞组成的排列疏松无规则的组织。,植物组织培养,外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分组织或器官1）外植体灭菌消毒（根尖、茎、芽、嫩叶、种子、花粉等）2）用消毒过的器械将外植体置于培养皿上3）切取所需的外植体4）将外植体接种于培养容器的培养基上整个试验
4、在超净工作台上进行，保持无菌！外植体经过一段时间在培养基上生长后，会形成愈伤组织,植物组织培养的培养基,定义：含有一定营养成分，供组织培养植物生长的基质无机营养成分：C，H，O大量元素及部分微量元素有机营养成分 含N物质：包括维生素和氨基酸 碳源：2%5%的蔗糖 琼脂：起支持作用 生长激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素PH值：5.06.0,试管苗大规模培养,融合细胞,杂种细胞,去壁的常用方法：,诱导原生质体融合方法：,融合成功的标志,人工诱导,筛选,2、植物体细胞杂交的过程,意义：克服远缘杂交不亲和的障碍,（1）植物繁殖的新途径,1）微型繁殖（快速繁殖）2）作物脱毒3）神奇的人工种子,（2）作物
5、新品种的培育,1）单倍体育种2）突变体的利用3）转基因植物的培育,（3）细胞产物的工厂化生产,3、植物细胞工程的实际应用,1.微型繁殖2.作物脱毒3.神奇的人工种子,一、植物繁殖的新途径,技术：原理：结构：优点：,胚状体（不定芽、顶芽、腋芽）人工薄膜：,加入适量无机盐、有机碳源等养分，农药、抗生素、有益菌及生长调节剂等,组织培养,细胞全能性,与天然种子比：解决某些作物繁殖力低、结子困难、发芽率低问题 保持优良品种遗传特性 不受气候、季节、地域的限制，时间短，占地少,与试管苗比：有人工薄膜保护，方便地贮藏和运输,？,(胚),二、作物新品种的培育,1.单倍体育种2.突变体的利用,对植物组织培养过程
6、中得愈伤组织进行诱变处理，促其发生突变，诱导分化成植株，筛选对人们有利突变体,进而培育新品种,新品种,外植体,愈伤组织,多种突变体,筛选,脱分化,再分化,诱变处理,3、转基因植物的培育,植物组织培养,4、植物体细胞杂交,植物细胞融合,植物组织培养,转基因细胞杂种细胞茎尖、根尖等分生区花药（花粉）,外植体,脱分化,愈伤组织,再分化,丛芽或胚状体,工厂化生产药物,人工种子,转基因植物杂种植物作物脱毒单倍体育种微型繁殖,、根,植物体,诱变处理,突变细胞,212植物细胞工程的实际应用,突变体的利用,+人工薄膜,培养,二、动物细胞工程,植物细胞工程常用的技术手段：,植物组织培养、植物体细胞杂交等,强调：
7、,是其他动物细胞工程技术的基础。,动物细胞培养,动物细胞核移植,动物细胞融合,单克隆抗体制备等,动物细胞培养技术,常用的技术手段：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,胰蛋白酶,剪碎,单个细胞,加培养液,制成,细胞悬浮液,去掉组织间蛋白,10代细胞,50代细胞,无限传代,部分细胞遗传物质改变,动物细胞培养不能最终培养成动物体,随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖,1.动物细胞培养:,如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？,遗传物质改变,贴壁生长细胞分裂生长到相互接触时就停止分裂增殖的现象叫接触抑制,植物组织培养和动物细胞培养的比较,均需适宜的外界条件：PH,温度,营养及“无菌、无毒环境”等。,固
8、体、营养物质、蔗糖、植物激素,培养成植株,液体、营养物质、葡萄糖、动物血清,培育成细胞系或细胞株,1.生产蛋白质制品（如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体、动物激素）2.用于某些器官移植,1.试管苗的快速繁殖2.无病毒植物的培育3.生产药物等4.人工种子5.转基因植物的培育,思考：,2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：液体培养基 成分中有动物血清等,因为这些组织或器官上的细胞生命
9、力旺盛，分裂能力强,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,物理法、化学法,灭活的仙台病毒,2、动物细胞融合,过程,制备单克隆抗体：,获得杂种植株,用途,物理、化学方法（同左）,生物：灭活的病毒,物理（离心、振荡、电刺激）,化学（PEG）,诱导方法,使细胞分散后诱导细胞融合,去除细胞壁后诱导原生质体融合,细胞融合的方法,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性、植物细胞全能性,原理,动物细胞融合,植物体细胞杂交,比较项目,植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较,主要用于制备单克隆抗体,细胞核移植,多莉羊的培育过程,3.核移植与克隆动物：,动物细胞核有全能性,特点：产量低、特异性差、纯度
10、低、反应不够灵敏,4、单克隆抗体,1、常规抗体制备：,一个B淋巴细胞：只分泌一种特异性抗体,2、单克隆抗体制备：,杂交瘤细胞,小鼠骨髓瘤细胞：能无限增殖,融合,抗原注入小鼠体内,已免疫的B淋巴细胞,骨髓瘤细胞,筛选出杂交瘤细胞,筛选出能产生特异性抗体的细胞群,从培养液中提取,从小鼠腹水中提取,细胞融合,动物细胞培养,单克隆抗体的制备,(特定的选择培养基),主要用于疾病的诊断、治疗和预防。若在单抗上带上抗癌药物制成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞。特点：与常规抗体相比，具有特异性强、灵敏度高、化学性质单一的优点。,单克隆抗体的应用：,单克隆抗体是指：,
11、杂交瘤细胞产生的单一抗体,结合同位素的单抗,-生物导弹,单抗,放射性同位素,例(06江苏)下图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。,（1）_技术是单克隆抗体技术的基础。（2）根据培养基的用途分类，图中HAT培养基属于_培养基。（3）单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是_。（4）动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用的诱导剂外，还可以采用_。（5）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的_特点，又具备淋巴细胞的_特点。（6）淋巴细胞是由动物体_中的_细胞分化、发育而来。（7）杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是_。,动物细胞培养,选择,特异性强,灵敏度高,灭活的病毒,在体外大
12、量增殖,分泌特异性抗体,骨髓,造血干细胞,主动运输,6、基因型为AaBb的水稻(具有24条染色体)的花粉通过无菌操作，接入试管后，在一定条件下形成试管苗的育种过程。(1)愈伤组织是花粉细胞不断分裂后的形成的不规则细胞团，愈伤组织形成中，必须从培养基中获得_。(2)要促进花粉细胞分裂生长，培养基中应有_和_ _两类激素。(3)愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，再由芽发育成叶和茎。这一过程必须给予光照，其原因是_利用光照制造有机物，供试管苗生长。(4)试管苗的细胞核中含有_条脱氧核苷酸链。(5)培养出的试管基因型有。如果要获得育种需要的植株，并能繁殖新品种，后面的育种步骤是_。,各种营养(水、无机盐、蔗糖等能量物质)和小分子有机物,生长素 细胞分裂素,叶绿体,24,AB、Ab、ab、a,用一定浓度的秋水仙素处理组织培养获得的幼苗,
