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1、体细胞遗传学研究的内容,体细胞遗传学是遗传学、细胞学和组织培养学相结合的产物。一般的细胞遗传学研究的内容是染色体在减数分裂过程中的行为及其遗传后果。体细胞遗传学主要研究离体培养的体细胞在有丝分裂过程中的遗传规律。,研究的范畴,真核生物体细胞的特点：在二倍体生物中，没分化的体细胞都有2n染色体数；在上代和下代体细胞间，染色体都是通过有丝分裂而传递的。体细胞：指植物体内除了孢子、配子和孢子母细胞之外的所有细胞。,研究的范畴,花药培养属于体细胞遗传学研究的范畴吗？在花药的培养中，花粉粒的发育偏离原来的方向，其结果不是形成雄配子体，而是经过连续的有丝分裂，形成单倍体愈伤组织或花粉胚。更重要的是，由花药
2、培养产生的单倍体更是体细胞遗传学研究的理想材料。,体细胞遗传学分类,种间体细胞遗传学：研究不同物种体细胞融合后异核体的遗传行为，对人工合成体细胞杂种有重要的指导意义。种内体细胞遗传学：对来自同一物种的体细胞进行研究，通过对细胞进行诱变、选择和互补分析等，不但可以获得新的基因型，而且有助于对某些一般性问题的了解，如基因的结构和功能，基因的表达和调控，细胞分化与发育的机制等。,自然条件下的细胞周期,正常的细胞周期：在顶端分生组织中，由于DNA合成之后立即进行核与细胞质的分裂，故细胞都保持在二倍体水平。异常的细胞周期：以上细胞的衍生细胞，在以后的分化过程中，进行核内有丝分裂和核内复制，结果是出现体细
3、胞多倍性。,中柱鞘、原形成层和形成层细胞保持二倍体状态，因此，通过茎尖培养产生的植株和中柱鞘起源的侧根始终是二倍体的。,物种分类,非体细胞多倍体物种(non-polysomatic species):裸子植物 10%的被子植物 向日葵、胡萝卜、麝香百合等体细胞多倍体物种(polysomatic species):90%的被子植物 豌豆、烟草、芍药等,离体培养中的遗传与变异,1 离体培养中的遗传稳定性 离体培养的细胞学基础是有丝分裂。有丝分裂的DNA半保留复制和染色体均等分裂机制，从理论上可以保证离体培养物在一般情况下的遗传稳定性。在准确选择培养方式的前提下，离体无性繁殖可以具有较高的遗传稳定性
4、（Phillip等，1994）。正是基于这一理论，利用离体培养技术建立了多种植物的无性繁殖体系。,2 离体培养条件下遗传变异的特点,2.1 普遍性 植物种类、培养方式、培养类型 不同的植物材料在不同的培养类型中都会发生变异。,表1 部分植物离体培养再生植株的表型变异频率,2.2 局限性 从表型上看，在不同植物类型中经常发生的体细胞变异主要是植株形态（株高、叶形、叶色等）、生长势、育性、某些抗性等性状的变异。从生理生化特性上看，容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异。一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性突变。,2.3 嵌合性：嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组
5、织培养中常见的现象。在自然界中，染色体数的嵌合性是由杂种或新近合成的多倍体的遗传不稳定性造成的。这种混倍体现象的出现表明，再生植株可能是由愈伤组织中一个以上细胞起源的。,影响体细胞遗传与变异的因素,1 供体植物 供体植物倍性水平 植物的基因型 外植体细胞分化程度,影响体细胞遗传与变异的因素,2 培养基及培养方式 Torrey(1961)，通过改变培养基成分，可有选择地诱导和保持倍性较高的细胞分裂。豌豆根段 基本培养基+2，4-D 二倍体细胞发生分裂 基本培养基+2，4-D+激动素+酵母浸出液 有选择地诱导四倍体细胞发生分裂。,培养基的物理状态以及培养类型也会引起细胞的变异。在悬浮培养的条件下，
6、选择压有利于二倍体细胞，而在半固体培养的条件下，四倍体细胞出现的频率较高。一般来讲，悬浮培养的细胞较半固体培养的细胞易产生变异。,影响体细胞遗传与变异的因素,3 继代培养的次数 一般来讲，继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的几率就越高。,体细胞变异的细胞遗传学基础,1 DNA核内重复复制 DNA在核内重复复制（endoreduplication）但不发生细胞分裂，其结果是染色体组数增加，形成同源多倍体。如果这种DNA重复复制多次发生，细胞内DNA含量就会不断上升。,体细胞变异的细胞遗传学基础,2 染色体断裂与重组 染色体断裂与重组是离体培养中染色体结构变异的主要原因之一，也是体细胞变异中经常
7、发生的现象。染色体结构变异的细胞学特征是：分裂中期出现断裂的染色体片段以及染色体桥，其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位等多种类型的结构变异。,体细胞变异的细胞遗传学基础,3 非正常有丝分裂 离体培养中，染色体除了整倍性变异外，还可观察到大量的非整倍性变异，这种愈伤组织往往分化能力低下，再生植株大多生长不正常，有性繁殖的遗传稳定性差。纺锤体形成异常使得有丝分裂不正常是其原因之一。非正常有丝分裂包括多极纺锤体形成和核裂。,体细胞变异的分子遗传学基础,1 碱基突变 碱基突变是指DNA序列中碱基的改变。如果改变碱基的DNA序列处于结构基因的位置或调控序列的位置，就可能导致遗传状态的改变。碱基
8、突变是产生体细胞变异的重要途径之一。对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳定遗传，而且符合孟德尔遗传分离规律，这一点已在水稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实（张春义和杨汉民，1994）。,体细胞变异的分子遗传学基础,2 DNA序列的选择性扩增与丢失 在许多植物中均观察到，DNA分子中一些重复序列在培养条件下发生了扩增。在许多植物种类中还观察到，在组织培养过程中，以及经组织培养再生的植株，甚至在这些植株的后代中，有时也会发生DNA序列丢失的现象。,体细胞变异的分子遗传学基础,研究还发现，DNA的减少不仅发生在核DNA中，也有发生在叶绿体基因组中。一些DNA序列的减少只发生在愈伤组织形成
9、阶段，植株再生过程中又恢复到正常状态，目前还不清楚这种变化的生物学意义。,体细胞变异的分子遗传学基础,3 转座子活化 转座子(transposon)：在基因组中可以移动的一段DNA序列。转座子首先是由McClintock在玉米中发现的，现已证实它是引起许多遗传不稳定现象的重要原因。,体细胞变异的分子遗传学基础,我国学者朱至清（1991）认为，可能是转座子在培养环境中首先被激活而转座，从而造成染色体的结构变异。目前关于转座子引起体细胞变异的直接实验证据还十分有限，但许多学者认为，用转座子解释体细胞变异有许多合理性，如变异频率高、沉默基因活化等。,体细胞变异的分子遗传学基础,4 DNA甲基化 DN
10、A甲基化（methylation）在基因表达调控中具有重要作用。离体培养再生植株的甲基化变化首先在玉米体细胞无性系再生植株中发现。胡萝卜、番茄、马铃薯等多种植物的培养细胞或再生植株中，均报道发现了因DNA甲基化改变而产生的体细胞变异（刁现民和孙敬三，1994）。,体细胞变异的分子遗传学基础,除了DNA甲基化程度的增加外，离体培养中的某些变异还来自于DNA甲基化程度的降低。最典型的例子是油棕体细胞胚植株由于甲基化的减少而造成的雄蕊雌性化变异。（Rival，1997）。,体细胞无性系变异的诱导与选择,1 体细胞变异诱导材料的选择 1.1 目标性状的可行性 体细胞突变的频率虽然较高，但对于某一个体来
11、讲，变异的性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状，是体细胞突变系选择的目的。,体细胞无性系变异的诱导与选择,1 体细胞变异诱导材料的选择 1.2 试验材料的细胞培养技术 必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技术，才有可能制定完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养技术不成熟，不能再生整株，则不能进行后续的各项操作。,体细胞无性系变异的诱导与选择,1 体细胞变异诱导材料的选择 1.3 合适的细胞类型 适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件。,培养细胞的诱变,1 物理诱变 物理诱变主要是通过射线、磁场以及温度等对培养物
12、进行一定处理，然后对处理后的培养物进行培养筛选。常用的射线处理包括X射线、射线、快中子、紫外线等。,培养细胞的诱变,2 化学诱变 常用的化学诱变剂主要有：烷化剂（硫酸二乙酯 DES，乙基磺酸乙酯 EES，甲基黄酸乙酯 EMS，环氧乙烷EO，乙烯亚胺 EI等），此类诱变剂有一个或多个活化烷基，可与DNA分子中的碱基或磷酸基结合，改变DNA的结构而引起突变。,培养细胞的诱变,2 化学诱变 碱基类似物（5溴尿嘧啶是胸腺嘧啶类似物，2氨基嘌呤是腺嘌呤类似物等），在细胞内核酸复制时，这些类似物可以掺入到新合成的DNA分子中引起错配。,培养细胞的诱变,3 复合因子诱变 诱变处理可以是单因子处理，亦可以是复
13、合因子诱变。一般来说，复合诱变的效果比单因子诱变好。,培养细胞的诱变,4 转座子插入诱变 可以独立插入通过其转座功能诱导变异。利用这一途径已在苜蓿、马铃薯、番茄、甘蓝等多种植物上获得可利用的体细胞变异植株。,体细胞突变体的筛选,1 直接筛选法 直接筛选法是在设计的选择条件下，能使培养细胞或再生个体获得直接感官上的差异，因此能将突变个体和非突变个体分离。最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，而非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。,体细胞突变体的筛选,2 间接筛
14、选法 间接选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。当缺乏直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时，可考虑采用间接筛选法。,体细胞突变体的筛选,如脯氨酸（Pro）作为一种渗透调节物质，在维持细胞膜稳定性、细胞水分平衡等方面具有重要的生物学意义。植物在非生物胁迫如干旱、低温等条件下，体内Pro常常有不同程度的升高，而且耐干旱和耐寒植物的体内Pro往往较高。,体细胞变异的利用,1 创造育种中间材料或直接筛选新品种 据统计，诱导突变已被用来改良诸如小麦、水稻、大麦、棉花、花生和菜豆这些种子繁殖的重要作物。在全世界50多个国家中，已培育出1000多个由直接突变获得的或由这些
15、突变体杂交而衍生的品种。这些品种的主要特性包括品质改良、增强抗病性和抗逆性等。,体细胞变异的利用,2 遗传研究 突变体作为基因克隆和标记筛选具有独特的优点。因为突变一旦发生，即可在表现型上与供体显著不同，通过差异显示或分子杂交筛选，即可快速获得突变位点的DNA序列，经过测序与功能鉴定，就可能获得与突变性状相关的基因。即使通过分析不能获得功能基因，这些DNA序列也可作为与突变性状相关的分子标记，用于相关遗传研究。,体细胞变异的利用,3 发育生物学研究 植物的个体发育是一个渐进过程，每一个器官和组织的分化都是一个复杂的调控过程。利用体细胞突变策略对植物发育的基因调控研究取得了突破性进展。特别是利用
16、拟南芥和金鱼草等模式植物，已分离出一大批不同发育阶段和组织类型的突变体，包括顶端分生组织、根、开花转变、花序、花分生组织、胚胎发育等的一系列突变体。通过对这些突变体的研究，不仅建立了器官发育模式，而且分离鉴定了一大批与发育有关的基因，包括维持正常发育状态的基因、促进发育进程的基因，以及相关修饰基因（许智宏和刘春明，1998）。,体细胞变异的利用,4 生化代谢途径研究 生物的各种代谢活动涉及到一系列酶相关基因的表达。如果某一代谢过程的关键酶基因突变，则会影响到下游代谢链的正常进行。因此，突变体作为代谢活动调控研究的工具，具有十分便利和高效的优势。,体细胞变异的利用,我们可以根据需要建立某一代谢途
17、径中每一个调节点的突变体，也可以根据需要与基因工程相结合，对一些关键调控过程进行修饰和改造，使代谢过程按照人类需要进行，因此而发展起来的新型学科领域称之为代谢工程。,体细胞变异的利用,植物突变体用于代谢研究，早期最经典的例子是通过烟草突变体对硝酸还原酶的研究。硝酸还原酶缺失突变体有两种类型：cnx和nia。两种突变体具有同一表现型，即在以硝态氮为唯一氮源的培养基上不能生存。但将这两种突变体的原生质体融合后，融合细胞即可在只有硝态氮源的培养基上生长。由此说明，两种突变体存在独立的基因位点，而不同位点的基因又可能通过不同的途径控制硝酸还原酶的活性。研究显示。cnx和nia突变体分别通过影响钼因子和
18、酶蛋白来影响硝酸还原酶的活性。,小 结,离体培养中遗传的稳定性是相对的，而体细胞变异发生是普遍的，但变异的程度可以通过培养类型和条件进行控制，从而使我们能够更好地应用离体培养技术。选用适当的外植体和培养方式，减少体细胞变异发生，使培养群体维持遗传稳定，可以充分利用离体培养的快速繁殖优势繁殖健康种苗。,小 结,将离体培养技术与诱变技术相结合，可以提高变异频率，增加变异选择的基础材料，丰富遗传资源。特别是随着诱变途径的不断完善和分子生物学技术的应用，必将使体细胞变异的研究和应用潜力得以更充分的发挥。,思考题：1 从细胞学和分子生物学机制上解释体细胞无性系变异的机制。2 体细胞无性系变异的诱导和选择方法。,
