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1、尿素分子的立体结构,CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3,脲酶,两个主要目的：（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。,研究思路,美国黄石国家公园的一个热泉,(一)筛选菌株,水生耐热细菌Taq(Thermus aquaticus)耐高温的Taq DNA聚合酶美国微生物学科布鲁克（T.Brock)1966年发现耐热细菌,培养基配方三 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO47H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g,培养基配方二 KH2PO4 3g MgSO47H2O 3g NaNO3 2g 葡
2、萄糖 10.0g 尿素 3.0g 琼脂 15.0g,培养基配方一 KH2PO4 3g Na2HPO4 1.4g NaNO3 2g MgSO47H2O 3g 葡萄糖 10.0g 琼脂 15.0g,（一）筛选菌株尿素细菌的分离,1.原理：根据某种微生物的特殊营养要求或其对物理、化 学因素（营养、温度、pH等）的抗性而设计的。,选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生 长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的 培养基。,2.功能：使混合菌群中的目的菌株变为优势菌，从而提高 该菌的筛选效果。,3.方法：利用选择培养基来实现。,（二）统计菌落数目,统计菌落数目的理论依据：当样品的稀释度足够高时，
3、培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30300的平板进行计数。,没有设置重复组，因此结果不具说服力。,1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误。,不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。,在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,统计菌落数目,测定微生物数量的方法：,1.稀释涂布平板法（
4、活菌计数法）：统计平板上的菌落数2.显微镜直接计数：3.滤膜法：是检测水样中大肠细菌群的方法。4.测定细胞重量法：此法分为湿重法和干重法5.测定细胞总氮量或总碳量,利用血球计数板(不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度),旁栏思考,1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。,（三）设置对照,在做本课题的实验时，A 同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学的
5、结果有问题。他们分析可能是A同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。但是，A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿了不出令人信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同学学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？,一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学
6、存在操作失误或培养基的配制有问题。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,实验设计,一土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,（二）土壤稀释,二、实验设计,旁栏思考,2.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 18
7、5万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,分离尿素细菌,用以判断选择性培养基是否具有选择性,对设计实验的训练,培养基的种类情况,162,106,菌落计数方法,1.首先选取平均菌落数在30300之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表中例）。2.若有两个稀释度，其平均菌落数均在30300个之间，则应求出两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于或等于2应报告其平均数，若大于2则报告其中较小的菌落数(见表中例2及例3)。,
8、3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例4)。4.若所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例5)。5.若所有稀释度的平均菌落数均不在30300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例6)。,（三）微生物的培养与观察,菌 落 特 征,大小、形状（圆形，假根状，不规则状）表面特征（光滑，皱缩，颗粒状，龟裂状，同心圆状）隆起形状（扩展，台状，凹面，凸面，乳头状）边缘情况（整齐，波状，裂叶状，锯齿状）表面
9、光泽（无光泽，金属光泽，闪光）质地（油脂状，膜状，粘脆）颜色、透明度,操作提示,一无菌操作1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。三规划时间,结果分析与评价,1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落：对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。2.样品的稀释操作是否成功：如果得到了2个或2个
10、以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。3.重复组的结果是否一致：如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要分析产生差异的原因。,在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,课题延伸,测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。,大肠杆菌呈 黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝培养基上典型特征,相关链接,（一）空气中微生物总数的检测（二）水中
11、细菌总数的检测（三）牛奶中细菌的分离与计数（四）土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,培养基的配制：最好用蒸馏水培养基的灭菌:可先灭菌再倒平板取土样：可事先采取措施使土壤中的尿素细菌 富集一些。,检测：酚酞的灵敏度不 如酚红，因此建 议最好使用酚红，否则效果不明显。,本课题知识小结:,2.反刍动物，如牛和山羊，具有特殊的器官瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能以尿素作唯一氮源。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。,
