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1、,内 容第一节 玻璃器皿及塑料制品的清洗与消毒第二节 培养操作的基本要领和要求第三节 细胞培养的基本技术,第一节细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒,一、清洗,目的：在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长有害物质包括：微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿、胶塞、塑料制品,1、玻璃器皿的清洗,包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤清洗后的玻璃器皿要求：干净透明无油迹不能残留任何物质,清洗：自来水洗，烘干 泡酸 自来水洗 去离子水洗 三蒸水洗 烘干 新瓶子均按该程序清洗，培养材料染菌的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。酸
2、液（洗液）：浓硫酸+重铬酸钾,浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。,新的初次使用的玻璃器皿先用自来水简单刷洗，然后用5稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质,培养瓶浸泡后还需要装满蒸馏水后上高压！,再次使用的玻璃器皿：用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。原因：常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉。,刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度,浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中的过程注意：浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时配制、
3、浸泡时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。,冲洗在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹。浸泡后的冲洗过程：,需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，蒸馏水浸泡过夜，自来水冲洗5遍，一蒸水5遍，二蒸水3遍，培养瓶要求二蒸水也用流水，烤干备用。,2、胶塞的清洗,新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理.,常规清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用。,3、塑料制品的清洗,塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的
4、包装，打开包装即可用，多为一次性物品。必要时用2%NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。,培养板、塑料离心管的清洗同玻璃器皿。但不能放在烤箱中干燥！,二、包装：目的：以便消毒及储存，防止落人灰尘及消毒后再次被污染。包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等！,各种用品的包装,器皿的包装分为半包装和全包装培养瓶 两个一组全包，包装前盖上螺旋盖子。吸管 在与胶头相接端塞上棉花装入吸管筒。青霉素小瓶 倒扣在饭盒中，全包。滤器 上下口半包装再用报纸包，最后用布包好。大的容器 如锥形瓶，加上棉塞后半包装。枪头、EP管 装在
5、相应的盒子中，全包。手术器械 放在饭盒中，全包。离心管 加盖子后全包,三、消毒、灭菌 防止培养物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除）灭菌sterilization：应用理化方法杀死所有病原微生物、非病原微生物和芽胞。消毒disinfection：应用理化方法杀死微生物，只要求达到无传染性的目的，不要求全部杀死。,无菌germ free：没有活菌。防腐antisepsis：应用理化方法防止和抑制微生物生长繁殖。抑菌（bacteriostasis）：抑制体内或体外细菌生长繁殖。常用的抑菌剂为抗生素,1、消毒灭菌的方法,物理方法:湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线。射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或
6、去除微生物。化学方法:使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。,2、消毒灭菌的注意事项,干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到 160，保持90120 min方能杀死芽孢。注意！消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进人，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。,湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。注意：1、不能装太满，保持消毒器内气体流通。2、在加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷空气排出！关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。,3、一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒的要求是 15磅 20 min；常规使用液体：消毒 15
7、磅 15 min。4、橡胶和塑料用品：如滤器、EP管、离心管等高压10磅15 min。,紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。时间为30分钟2小时左右。过滤除菌消毒：适用于组织细胞培养使用的液体如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。,3、常用设施的消毒及灭菌,培养室：紫外线照射、乳酸熏蒸台面：紫外线照射、70%乙醇擦拭培养箱：新洁尔灭擦拭培养瓶、培养皿等：用报纸包好高压蒸汽灭菌滴管、枪头等：装载相应的容器中用报纸包好高 压蒸汽灭菌培养板：紫外线照射12小时以上。培养基：过滤除菌,、,第二节 培养操作基本要领和要求,防止污染是决定培养成功或失败的首要条
8、件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。一、培养前准备1、制定出分门别类的操作卡片。如“分装血清”、“组织块贴壁初代培养”、“传代培养”、等等。各卡片上记有需用器材和物品名称、要求及数量等，好处是实验者可按卡片收集所用物品，清点无误后，把用品放置于操作场地，然后进行消毒。,2、操作野消毒：现多用紫外线灯灭菌，效果很好。用30 瓦紫外线管灯，操作箱消毒20 一30 分钟即可；操作室空间大，需消毒3050 分钟。在用紫外线灯照射期间，在操作台面上勿置培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响(必要时可用纸张覆盖)。紫外线只有直接杀菌作用，工作野用品过多或重叠放置，物
9、品相互遮挡射线，会降低消毒效果,3、洗手和着装：原则上和外科手术相同。在利用无菌箱工作时，因整个前臂要伸入箱内，洗刷时一定要清洗到肘部。75酒精，进行擦洗消毒；必要时亦可用0.2的新洁尔灭洗涤消毒。进行培养工作时，如利用净化台，仅戴口罩和工作帽，着一般工作服即可。在无菌室内工作需着消毒衣帽。,二、火焰消毒：在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后操作，如安装吸管帽、启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进行。已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼！因吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入培养液中。消毒火焰要求无色或微蓝色，而红黄色或发黑的火苗，表示燃烧不完
10、全或含有杂质，有害物能混入培养液内。因此酒精灯需用96的不含杂质的酒精，绝不能使用含有二甲苯和甲醇的酒精。,三、培养操作注意事项1、进行培养操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。2、不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时，应取备品更换。3、布局：原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央(图4-1)。工作由始至终要保持一定顺序性。,4、组织或细胞在末做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在使用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。5、培养用瓶开瓶以后，皆应保持45 度斜位或平放，吸取营
11、养液BSS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。6、工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。,第三节 基本培养操作技术,一、传代培养法,当初代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，进而扩展汇合，占满一切空间，此时需要进行分离培养。这一操作称传代或再培养。80%汇合或刚汇合细胞是理想传代阶段。为什么要进行传代？,1、贴壁细胞传代,贴壁细胞,贴附生长型细胞,细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板,+,+,细胞的贴附过程,贴附物质带正电荷,细胞带负电荷,成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起,上皮细胞：扁平
12、、多角形、园核,可连成单层,材料和试剂 Hela细胞 RPMI1640生长液、碳酸氢钠、双抗 EDTA消化液（0.02%）培养瓶、无菌吸液管（5ml、1ml）、弯头毛细滴管、废液缸,图5-6 消化法传代培养步骤,【程序】(1)吸除培养瓶内旧培养液；(2)向瓶内加入EDTA 混合液少许，以能覆满瓶底为限；(3)置温箱中25 分钟(或在室温中，把培养瓶放在倒立显微镜台上镜下观察)，当发现细胞胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化；(4)吸除消化液,(5)用吸管吸取营养液（已经加入双抗并调好pH值）加入培养瓶，轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液；吹打勿用力过猛，以免伤害细胞；(6)计数
13、板计数后(如非实验用，不计数亦可)，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。,2、悬浮细胞的传代培养,悬浮生长型细胞,材料和试剂 HL-60细胞 RPMI1640生长液、碳酸氢钠、双抗 培养瓶、无菌吸液管（5ml、1ml）、弯头毛细滴管、废液缸,二、操作步骤l、选生长良好的HL-60细胞一瓶 轻轻加入等量的生长液。2、用无菌吸液管轻轻吹打，使HL-60细胞均匀悬浮 然后吸出一半的细胞悬液加人另一个培养瓶中。3、如果细胞比较浓，可按1:3分配传代培养。,二、初代培养法,意义：初代培养或原代培养，是从供体获取组织后的首次培养。其最大优点是：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大的变化
14、，具有二倍体遗传性状，在供体来源充分、生物条件稳定的情况下(年龄、性别)，在一定程度上能反映体内状态。初代培养细胞是研究基因表达的理想系统。采用初代培养细胞做实验，如药物测试等效果也很好；初代培养也是建立各种细胞系(株)必须经过的阶段。,1、原则：幼体组织尤其是胚胎组织比年老个体的组织容易培养；分化程度低的组织比分化程度高的容易生长；肿瘤组织比正常组织容易培养。一般在无特定要求时，取易培养的组织进行培养，成功率高。,（一）取材,注意事项：取材之后，最好立即培养，如因故不能培养时，应把组织切成1 立方厘米左右的小块，置于培养液中，4贮存；存放时间不宜超过24 小时。从体内取材时，应严格保持无菌，
15、取肿瘤和其它病理组织时容易带菌，为减少污染，可用含500 1000 单位毫升的青、链霉素BSS 液，漂洗5 10 分钟后再做培养处理。,1、鼠组织取材,各种组织取材,2取皮肤：人皮肤是常用的培养材料，对供体无特定要求时，可利用手术时取材：请术者手术时切取l 2cm2 皮肤，即满足培养要求。取皮肤时可在上臂和大腿内侧等处，先用肥皂洗净取材部位皮肤，用75酒精擦拭消毒2 3 次(勿用碘酒)。取材方法可按如下两种方法：一是用注射器针尖轻轻斜刺入表皮内2 毫米左右，向上挑起一个小的皮丘，然后用手术刀紧贴针尖下方，切下直径2 3 毫米小片，深度以创面微见血迹为度；二是用拇指和食指把取皮部皮肤紧捏起，在绷
16、起的皮肤表面，用手术刀轻轻片取一小片表皮，大小和深度同前。,3取体液：血液白细胞是常用的培养材料，一般多用静脉取血法。亦可从耳垂或指尖取血。从无名指肚取血很好，血多，消毒和取血都方便，刺口恢复很快不易感染。从手指取2 3 滴血即够一次培养，血用量多时需从静脉采取。为防止凝血，常用肝素等抗凝剂；吸出血后拔掉针，立即把血注入无菌容器中备用。取骨髓组织、羊水、胸水和腹水可委托临床有关科室，按不同手术规程取材。,（二）组织的分离,目的：为获取多量生长良好的细胞，必须把组织细胞分散开，使细胞解离出来；能达到单细胞水平更好，同时并不使细胞受伤害，细胞能很好生长。分散组织的方法有离心法、机械法和化学法三种；
17、,1离心分离法,培养物为血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液时，可采用离心法分离。一般用低速500 1000 转分速度，离心5 10 分钟即可。如悬液量大，离心时间可适当延长，但如离心速度过大和时间太长，易压挤细胞使之受损或死亡。,淋巴细胞分离法,原理：淋巴细胞分层液(Lyphocyte Separation Medium)效果很好。分层液是根据细胞比重不同，使各类细胞相互分开的。红细胞比重1.092，淋巴细胞和大单核等白细胞比重为1.070；分层液适用于分离血中淋巴细胞。(1)取抗凝血若干毫升；(2)按1:1 加入无菌分层液(滤过除菌)后，800 1000 转离心；(3)无菌分离出白细胞(白细胞
18、位于红细胞上层，呈微白色)；(4)BSS 漂洗1 2 次，可用于培养或其它实验。注意：如用动物血(如小鼠)，白细胞的比重与人不同；小鼠白细胞比重为l.080 左右，需用相应比重的分层液。,2机械分散法：切割分离法：在进行组织块培养时，可采用剪切法，一般多剪切成1 mm3 大小的块。具体操作如下：,无菌切取1 cm3 组织一块，置入青霉素瓶或小烧杯中，左手斜持容器，右手持眼科尖剪或弯剪(剪柄较长为好)伸入容器中，反复剪切组织至1mm3 大小为止(成糊状)。然后用吸管吸取Hanks 液把附着在剪刀上的组织小块冲下，并再补加3 5 毫升Hanks 液后，用吸管反复轻轻吸吹冲打片刻，低速离心、去上清、
19、余下组织块即可用于培养。剪刀剪切法可能对组织有一定损伤，但操作比较方便。,压挤法,3消化分离法：组织消化法是在把组织剪切成较小体积的基础上，应用生化和化学手段进一步分散组织的方法。最后成细胞团或单个细胞，然后加入培养液制成细胞悬液，接种入培养容器中后，细胞容易生长增殖。各种消化剂的作用机制各不相同，根据组织的不同，可选用特定的消化手段。,1消化培养法(单细胞培养）,(三)原代细胞培养类型,(1)准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20 分钟；注意：组织块、胰蛋白酶、培养液等易受紫外线伤害的物品，最好在培养时再携入操作野；如预先置入，需用纸张覆盖，以免受射线影响；(2)处理组织：
20、把组织块置入烧杯中，用Hanks 液漂洗23 次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3060 分钟；(3)剪切：用眼科剪把组织块切成23 毫米大小的块(用手术刀切割亦可)，以便于消化；,(4)消化：加入比组织块总量多3050 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞；或用恒温水浴，或置)37温箱消化均可，消化中每隔20 分钟应摇动一次，消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。,(5)分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块(必要
21、时可继续进行消化)；低速(5001000 转分)离心消化液5 分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液(如用其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks 液洗脱一两次后，再加入培养液)；,(7)计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中；对大多数细胞来说，pH 要求在7.27.4 范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整；(8)培养：置入36.5度 温箱培养；如用CO2 温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需更换新塞。,2、组织块培养法:,【程序】(1)剪切：把组织小块(1cm3)置入小烧杯或青霉
22、素小瓶中，用Hanks 液漂洗23 次以去掉表面血污，吸净Hanks 液，用眼科剪反复剪切成lmm3 块为止；(2)摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置入培养瓶中；用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底上，小块相互距离为0.5cm 为宜，每一25ml 培养瓶底可摆布2030 块；(3)轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上；注意翻瓶时勿令组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5温箱2 小时左右(勿超过4 小时)，使小块微干涸；,(4)培养：从温箱中取出培养瓶，开塞，46 度斜持培养瓶(瓶底仍向上)，向瓶底角部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块(组织小块附着尚不牢，注意不
23、要把组织块冲走)；置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后，再补加培养液。,三、细胞计数 一、原理 细胞计数结果以细胞数/毫升表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。用台酚兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。,二、仪器、用品与试剂1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管2、试剂：0.4台酚兰(台酚兰 0.4克 加双蒸水至100ml)3、材料：细胞悬液(细胞悬液的制备：用毛吸管吸5滴细胞悬液到一
24、小试管中，加入1滴台盼蓝染液（0.4）或苯胺黑，混匀，静置23min,活细胞不会被染色，而死细胞着蓝色，这样加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。),三、操作步骤 1、将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：（细胞悬液的细胞数）/ml（四个大格子细胞数/4)稀释倍数104/ml,说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以2于染液是1：1稀释。公式中乘以104因为计数板每一个大格的体积为：1.
25、0mm（长）1.0mm（宽）0.1mm（高）0.1mm3 而 1ml1000mm3。四、细胞计数要点1.要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。,3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更意每次取样都要混匀，以求计数准确；4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。5.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。,五、初学者易犯的错误：1.计数前未将待测悬液吹打
26、均匀。2.滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。3.滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁 边的槽中。,细胞计数原理,四、细胞冻存1原理：在不附加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水会结成冰晶，能导致细胞发生一系列变化，最终导致细胞死亡。但如向细胞培养液中加入保护剂甘油或二甲基亚矾(DMSO)，可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，可避免上述现象的发生。当前最常用的保护剂仍为甘油和DMSO，它们对细胞无毒、分子量小、溶解度大、易穿透细胞，使用范围在5 15之间，常用10。,2要点:为保持细胞最大存活率，一般都采用慢冻快融的方法。,各种细胞对冻存速度的要求也不一样
27、；上皮细胞和成纤维细胞耐受性可能大些，另外用什么防护剂合适和用量多大，要依细胞而定，初代培养细胞用DMSO 较好，一般细胞可用甘油；用量以较小为好。有人认为人皮肤上皮细胞贮存在20 30甘油中很好。原则上细胞在液氮中可贮存多年，但为妥善起见，冻存一年后，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。,程序(1)细胞处理：选对数生长期细胞；收集细胞24 小时前换液一次；(2)冻存液：先用培养液9 分+DMSO 1 分(或甘油)配成10的DMSO 冻存液；按按常规法把细胞制成细胞悬液，计数、令细胞密度达107ml(一般用4瓶细胞)，(4)分装：分装入无菌冻存管中，每管加1.5 毫升细胞悬液；(5)封口：拧紧冻
28、存管盖，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察；,（6）入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找；(7)冻存：当前已有专用细胞冻存器；在无冻存器的情况下，可用手工办法：4 1h、-20 2h、85 1h、从把冻存物悬在液氮罐口开始算起，按-1-12分钟速度，在30 40 分钟内，下降到液氮面，再停30 分钟后，直投入液氮中。注意：操作时应带保护眼镜和手套，以免液氮伤人；细胞注入安瓶中后一定封严，最好使用塑料制螺口安额，但一定要拧紧螺帽。,五、冷冻细胞复苏方法,程序(1)从液氮罐中取出冻存管；有时冻存管因
29、末封严，浸入了液氮，取出后因安额内液氮迅速气化而发生爆炸(力量有限)，因此应带防护眼镜和手套；(2)迅速放入盛有36 37水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻，要在一分钟内溶解；(3)用70酒精擦试消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml 培养液，吹打使细胞悬浮；,(4)低速离心(500 1000 转分)5 分钟。(5)去上清，加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。注意：冻存细胞数量要充分，在融解后能允许做1：10 倍或1：20 倍的稀释(细胞数毫升)；一般每瓶细胞接种浓度为5105m1，因此冻存密度应达到107
30、ml，在稀释20 倍时，仍能保持5105ml 数量。,六、细胞运送一是用液氮或干冰保存，效果较好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸发均较快，适于空运，比较麻烦；,二为充液法：(1)选生长状态良好的细胞，待达80或90汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部(过满易污染)，保留少许空间，塞紧瓶塞；空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落；(2)妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响；(3)到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置37培养，次日传代。,七、收到细胞的处理方式,1.收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即通
31、知。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于70 C，隔夜后，移到液氮)。2.冷冻细胞解冻程序:1）依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。2）FBS(fetal bovine serum,胚牛血清),CS(calf serum,小牛血清)和HS(horse serum,马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。,3）将培养基置于37 C 水槽中回温，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。4）依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 fl
32、ask中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基，混合均匀，放入 37，5%CO2 培养箱培养。,5）对绝大多数细胞而言，1%以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除DMSO 者，则可将解冻后之细胞悬浮液放入5-10 ml 培养基中，离心(约1000 rpm)，5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后，转移至培养瓶中，再放入37，5%CO2 培养箱培养。,收到T25 flask 细胞时，处理
33、方式为 1.于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。请检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。2.将原封之T25 flask 静置于37，5%CO2 培养箱中，使细胞回温至37，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做传代培养。,八、加支持物培养法,加支持物培养法是预先向培养容器中加入各种可使细胞贴附的支持物，进行培养的方法。待细
34、胞贴附于支持物生长增殖后，可进行各种实验和观察。观察时可把支持物从瓶中抽出，能做各种技术处理，是研究工作中常用的方法之一。各种对细胞无毒性的如玻璃、塑料、鸡卵壳膜、胶原、硅橡胶、袋泡茶包装纸等，均可做支持物用。,1支持物制备特制有机玻璃、特氟隆薄膜、玻璃等：其中以玻璃片和特氟隆薄膜最为多用。前者便于做各种固定、染色处理和观察；后者最适做电镜技术，允许做包埋和切片。加支持物培养法程序与一般培养法相同，只是在培养前需在培养瓶中加入已消毒的支持物。特氟隆薄膜为定型无菌包装产品，用时无菌条件下启封，用剪刀按需要剪成各种不同大小的块，于培养接种细胞前，先置入培养容器中即可。,通常多用盖玻片做支持物，用前先要把盖片用玻璃刀切成一定形态，以便装入培养瓶中，按如下顺序处理：自来水浸泡24 小时96酒精3060 分钟蒸馏水浸泡3060 分钟用干净软布擦拭干净(擦时应戴白手套工作)装入培养器皿中高压或干热灭菌备用。,
