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1、自身免疫病是一大类以产生各种各样的自身抗体为特征的全身或局部性疾病，如系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎（RA）、皮肌炎、硬皮病以及免疫性不孕症等，其较高的发病率和严重的危害程度越来越受到医学界的关注，由于不同的自身免疫病具有不同的自身抗体谱，因此自身抗体的研究对自身免疫病的诊断、鉴别诊断、治疗及疗效监测均有重要的意义。,迄今为止，已发现的自身抗体将近100种，应用于临床的自身抗体也已达数十种。新的自身抗体还在不断的被发现和应用。DNA自身抗体作为一种经典的且被广泛应用的自身抗体，在自身免疫病的研究中发挥了重要的作用。但DNA作为一种特殊的自身抗体，还存在许多未解之谜，因此，人们对DNA
2、自身抗体的研究和探索始终没有停止。本次讲座主要讨论一下DNA抗原以及其相对应的DNA自身抗体的研究和临床应用。,DNA自身抗体的研究进展,南京军区福州总医院全军检验中心,Center for Lab Medicine PLA,Center for Lab Medicine PLA,兰 小 鹏,一、DNA抗原的分子特性,1.DNA分子的基本构象：右手双螺旋（B-DNA）左手双螺旋DNA（Z-DNA）B-DNA和Z-DNA又称双链DNA（double stranded DNA,ds-DNA)或天然DNA（native DNA,nDNA)单链DNA(single stranded DNA,ss-DN
3、A)或称变性DNA,2.DNA分子的抗原特性)不同构象的分子之间的抗原性差别甚 大，但又彼此交叉，还可互相转变。）DNA分子具有多抗原决定簇的特点：与抗体结合时的亲和力较高。）DNA抗原具有多聚阴离子特性：易产生非特异结合反应。,)ds-DNA的抗原决定簇存在于ds-DNA分 子的构象之中。,）DNA抗体与DNA的结合能力与DNA抗原的分子量有一定的关系，分子量越大，结合率越高。只有35bp以上的片段才能有效地与抗ds-DNA抗体结合。,）DNA抗体与DNA的结合能力与DNA抗原 分子的碱基组成有关：G+C含量高的 DNA分子更易与抗体结合。）DNA分子中含有某些复杂或特殊的结构时，更易与抗体
4、结合：如含有较多的重复序列、CpG及甲基胞密啶(mC)。,二Ds-DNA分子的免疫原性.用常规的免疫方法，ds-DNA一般不能诱导动物产生相应的抗体。.来源于原核生物的ds-DNA比真核生物的 ds-DNA更容易通过免疫动物来制备抗体。.在某些特定的情况下，真核细胞的ds-DNA才具有免疫原性。,三DNA的单克隆自身抗体与常规的单克隆技术相比，自身单克隆抗体的制备更为简便，不需要人工免疫动物，直接将自身免疫病的动物模型的脾细胞或病人的外周血淋巴细胞与相应的瘤细胞株融合就可建立杂交瘤，采用不同的抗原进行筛选，则可获得多种单克隆抗体。,按融合细胞的来源不同，DNA抗体的杂交瘤可分为三类：1.鼠鼠杂
5、交瘤：将近交的SLE小鼠模型的脾细胞与鼠的骨髓瘤细胞进行融合。2.人鼠杂交瘤：用SLE病人能分泌DNA抗体的B细胞与鼠的骨髓瘤细胞融合。,.人人杂交瘤：用SLE病人的外周血淋巴细胞或脾细胞与人的骨髓瘤细胞融合。另外将经过EB病毒转化的SLE病人的B淋巴细胞进行克隆，这种转化的B细胞亦可分泌抗ds-DNA。此法更为简便，因为细胞融合的步骤也不需要了，但这种EB病毒转化的B细胞产生抗体的量比较少。,人人DNA杂交瘤及其分泌的抗DNA抗体研究的意义：1.通过分析单克隆抗体的特异性，可以更进一步地了解DNA在SLE中的作用。2.作为抗原，DNA抗体又可诱导抗DNA抗体的独特型抗体。这种抗独特型有助于研
6、究SLE产生DNA抗体的调控机制。3.这种杂交瘤细胞本身可用于分析与自身抗体的产生有关的基因结构。,DNA的单克隆抗体存在的问题1.代表性的问题：作为一种多抗原决定簇的分子，由其引发的免疫反应包含了许许多多针对不同抗原决定簇的多克隆抗体。显然，只针对一个或少数几个决定簇的单克隆抗体，代表不了DNA引起的整个免疫反应。,2.单克隆抗体可能因静电引力与“粘性”分子呈非特异结合。3.由于不同来源的分子之间的相似性以及某些在化学结构和性质上与DNA相似的化合物的存在，使DNA单克隆抗体的交叉反应显得尤为突出。,四DNA抗体的交叉反应 几乎所有的DNA单克隆和多克隆抗体既能与ds-DNA又可与ssDNA
7、反应，而且在多数情况下，DNA抗体与ssDNA的亲和力更高。但是单纯针对ssDNA的抗ssDNA抗体则只能与ssDNA结合不能与ds-DNA结合。,DNA抗体能结合的分子包括ZDNA、某些人互合成的多核苷酸如poly(I)、poly(dT)、poly(dAdT)，POLY(dGdC)等。不少多聚阴离子化合物如心磷脂和其它磷脂、硫酸右旋糖酐、透明质酸和硫酸软骨素以及硫酸肝素等都可与ds-DNA抗体结合。,研究和了解抗DNA的交叉反应的临床意义：1.解释SLE病人出现梅毒试验阳性的现象。2.利用抗ds-DNA抗体与硫酸右旋糖酐（DS）的反应，可将DS吸附在硝酸纤维素柱上，用来去除SLE病人血中的抗
8、ds-DNA抗体。,3.对抗ds-DNA抗体和ds-DNA在SLE的发病机制中的重新评价。传统的观点：免疫复合物沉积学说。新的观点：DNA抗体可能通过与肾小球某些成分上的抗原的交叉反应，或者通过电荷的作用，直接结合在肾小球基底膜上，产生阻塞或导致补体介导的炎症和组织损害。,五DS-DNA抗体的独特型独特型(Idiotype,Id)：通常是指位于抗体可变区的抗原决定簇。私有Id(private Id)：只存在于某一种类型抗体中的Id。公共Id(public Id)：几种或多种抗体共同拥有的Id。,16/6公共Id：在活动性的SLE中，有一半以上的病人血清中的DNA抗体带有的一种公共Id。16/6
9、Id与SLE的活动性有关，病情活动时，16/6Id的滴度上升，反之则下降，SLE病人受损的组织中亦显示有16/6的沉积。,研究16/6Id的重要意义是：16/6Id可以诱导正常的小鼠发展成SLE。因此SLE极有可能是一种由Id诱导的疾病。两种假设：1.6/6Id（Ab1）免疫小鼠，刺激产生了抗16/6Id（Ab2），Ab2又可刺激小鼠产生抗抗16/6Id（Ab3）。,Ab3则带有原来的病理性16/6Id，这种抗体可能就是抗DNA抗体，后者可导致SLE的发生。2.针对16/6Id的抗16/6Id与自身抗原（DNA）相似。因此，这种抗16/6Id 的产生又使小鼠产生抗抗6/6Id，后者可与DNA反
10、应。,六抗ds-DNA的检测1.免疫萤光法（IFT）2.放射免疫法（RIA）3.ELISA4.斑点免疫金渗滤法（DIGFA）5.生物芯片法,优点：1.目前仍为检测抗dsDNA抗体的金标准。2.特异性高3.可同时检测ANA和抗dsDNA抗体。4.可半定量检测抗dsDNA抗体（滴度）。,缺点：1.敏感性不高。2.短膜虫的培养和传代比较费时费事。3.操作方法也比较烦琐、不易标准化。4.近几年也有假阳性报道。,优点：1.敏感性较高。2.可以定量测定dsDNA抗体。缺点：1.假阳性率较高。2.有放射性污染。,。,优点：1.方法比较稳定，应用广泛。2.可以定量，但多数情况下只是定性测定。缺点：1.试剂盒大
11、多为进口产品，价格较高。2.操作步骤较多，比较费时。,优点：1.快速、简便，只需2分钟，2个步骤。2.敏感性与ELISA相当，特异性与免疫荧光法相近。缺点：不能定量。,优点：1.高通量，可同时检测多份标本，多种自身抗体。2.可定量测定。缺点：成本较高，可通过灵活多样的组合降低成本。,流式荧光检测仪,Luminex 100多功能流式点阵仪,流式荧光检测仪,流式荧光技术,流式荧光技术激光激发荧光的发光类技术之一(Bead Based)Suspension Array（基于微珠的）悬浮阵列LiquidChip（QIAGEN）液态芯片、液体芯片、液相芯片Flexible Multi-Analyte P
12、rofiling systemxMAP多功能多指标并行分析系统Bead/Microsphere Array微珠阵列,荧光编码微球技术,共价交联技术,蛋白、核酸反应模式,核酸,抗原,抗体,检测模式,通过类似流式细胞技术，逐颗分析红色激光635nm，识别不同编码的微球绿色激光532nm，用于检测检测信号,检测流程,固相反应模式,流式荧光反应模式,微量标本，1次检测，100个指标,七抗ds-DNA在SLE诊断和治疗监测中的作用1.抗ds-DNA是公论的SLE的标志抗体，1982年国际风湿病协会把抗ds-DNA阳性列为SLE的诊断标准之一。2.抗ds-DNA在活动性SLE的病人中阳性率高（可达以上）。,3.抗ds-DNA可以作为监测SLE病情的指标。4.带有16/6Id的抗ds-DNA可以传递SLE。5.去除血液中的抗ds-DNA可以使SLE的症状得到缓解。,谢谢！,
