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1、,细胞培养(cell culture)技术 即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于生物技术研究领域的重要技术。,细胞系,培养物开始第一次传代培养后的细胞有限细胞系（Finite Cell Line）连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）肿瘤细胞系或株我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞。具有不死性和异体接种致瘤性。,细胞株,用单细胞分离培养增殖形成的具特定生长特性的细胞群再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。,原代培养,直接从体内取出的细胞进行的第一次培养物。优点：组织细胞
2、刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。,大鼠肝细胞原代培养1.细胞种类：大鼠原代肝细胞；2.培养的天数：刚分离，未经培养；3.细胞状态与特征简述：刚分离时球形透亮，贴壁，后呈不规则。,传代培养,将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。,HepG2细胞 细胞种类：人肝肿瘤细胞；培养的天数：传代培养2天；细胞状态与特征简述：呈多角型、不规则 贴壁生长，成团聚集。,细胞分离方法,离 心 机械或酶法 杂交瘤 愈伤组织酶消化
3、 原生质体,动物细胞,植物细胞,细胞培养方法,悬浮 固体 贴壁 液体浅层微载体 液体悬浮,动物细胞,植物细胞,细胞培养目的,疫苗 色素 激素 药物 多肽药物 香精 抗体 酶 酶 皮肤等,动物细胞,植物细胞,第一节 动植物细胞中酶生物合成的调节,动植物细胞的基因表达和调节控制比微生物复杂得多。,1、细胞分化改变酶的生物合成 基因表达的时间性和空间性2、基因扩增加速酶的生物合成 通过增加基因的数量来调节基因表达的一种方式。3、增强子促进酶的生物合成 高效增强某些酶基因的表达，具有细胞或组织特异性。4、抗原诱导抗体酶的生物合成 抗体酶,抗体酶 或催化抗体（Catalytic antibody)是一种
4、新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。制备的方法主要有：修饰法和诱导法。诱导法：半抗原诱导法和酶蛋白诱导法。,与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。,动物细胞模式图,植物细胞结构,动物，植物和微生物细胞特性比较,三者之间的差异主要有：植物细胞动物细胞微生物细胞。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。植物细胞和动物细胞对剪切力敏
5、感。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。,第二节 植物细胞培养产酶,1902年，德国植物学家G.Haberlandt就预言植物细胞培养的可能性。1937年前后，法国和美国科学家分别成功的进行了胡萝卜和烟草的组织培养。1966年Klein指出，能利用植物细胞培养物代替收集或栽培植株来生产生化制品。近40年来，植物细胞培养研究成功的例子已有不少，如用紫草悬浮培养物生产紫草宁；烟草细胞的大量培养等等。,与微生物相比，植物细胞具有的特性,细胞大，细胞壁以纤维素为主要成分，耐拉不耐扭，抗剪切能力低；与动物细胞培养类同，生长速率慢，为防止培养过程中染菌，需加抗生素；细胞培养需氧，而培养液粘度大，
6、且不能强力通风搅拌；产物在细胞内且产量低；细胞常生长成各种大小的团块，增加了悬浮培养的难度等。,20世纪90年代以来，伴随着紫杉醇的研究成功并应用于临床，植物细胞培养及其次级代谢产物的研究进入了新的发展时期，尤其是诱导子、前体饲喂、两相法培养、质体转化、毛状亘和冠瘿瘤组织培养等新技术和新方法的发现和发展，更显示了植物细胞培养工程制药的广阔发展前景。另外，将固定化技术应用于植物细胞培养中的研究对有效的改善植物细胞培养中出现的不足有一定成效。可以认为，固定化技术是有可能在植物细胞培养中得以应用。,植物细胞培养是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细
7、胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。,一、植物细胞培养产酶 1.植物细胞培养的特点（1）提高产率（2）缩短周期（3）易于管理，减轻劳动强度（4）提高产品质量（5）其他 如光照,植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较,目前，植物细胞培养技术已在农业、医药、食品、化妆品、香料等领域广泛用于大规模生产有价值的产品。小规模的细胞培养通常在培养瓶中完成，而大规模的培养可在发酵罐中进行。,2.培养基特点 植物细胞可以在简单的合成培养基上正常生长，用于植物细胞培养的基础培养基成分基本上与整个植物的要求一样。根据特定的植物种类和培养系统，培养基的基本营养成分可作适当的调整。应用最广的是MS
8、培养基和LS培养基 MS培养基是1962年由Murashinge和Skoog为烟草细胞培养而设计的培养基。LS培养基是在其基础上演变而来的。,植物细胞培养基的组成,植物细胞培养基通常包括无机盐、碳源、维生素、生长调节素和有机添加剂等。无机盐类 包括：大量元素 无机盐 微量元素主要包括碘、硼、锰、锌、钼、铜、钴、铁等。碳源和能源 蔗糖（植物细胞碳源和能源相同）维生素 植物细胞的生长都需要硫胺素。可在植物细胞培养基中加入烟酸、吡哆醇、泛酸、生物素和叶酸等。原生质体培养通常需要大多数必需维生素。,植物生长激素 大多数植物细胞培养基中都含有天然的或合成的植物生长激素。生长激素包括了植物生长素、细胞激动
9、素、赤霉素和脱落酸等四大类。有机氮源 通常采用的有机氮源有蛋白质水解物、谷氨酰胺或氨基酸混合物等。有机酸 加入丙酮酸，或者柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等三羟酸循环的中间产物，能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长，并且使细胞对钾盐的耐受能力至少提高到10mmol/l。除此之外，这些有机酸还能提高低密度接种的细胞和原生质体的生长。复合物质 在植物细胞的培养过程中，酶母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁等复合物质通常可以作为细胞的生长剂。,3.培养方法：悬浮细胞培养（细胞工程讲）,（1）外植体的选择与处理 外植体指从植株取出，经过预处理后用于植物组织和细胞培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、
10、花、果实、种子等）片段或小块。（2）植物细胞的获取 主要有直接分离法、愈伤组织诱导法和原生质体再生法等,愈伤组织：将外植体植入诱导培养基中，于25左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。,（3）细胞悬浮培养悬浮培养：植物细胞的悬浮培养是一种使组织培养物分离成单细胞并不断扩增的方法。在进行细胞培养时，需要提供容易破裂的愈伤组织进行液体振荡培养，愈伤组织经过悬浮培养可以产生比较纯一的单细胞。用于悬浮培养的愈伤组织应该是易碎的，这样在液体培养条件下能获得分散的单细胞，而紧密不易碎的愈伤组织就不能达到上述目的。,（4）分离纯化如利用大蒜细胞悬浮培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得
11、到超氧化物歧化酶。,水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织,4、植物细胞培养的条件控制,（1）温度的控制 一般在室温范围（25）（2）pH的控制 在微酸性范围 pH5.0-6.0（3）溶解氧的控制（4）光照的控制（5）前体的添加（6）刺激剂的添加,5.植物细胞培养产酶实例 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例(1)大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中，在25，600lux
12、，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。,(2)大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA（苄基腺嘌呤）的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25，600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。（3）SOD分离纯化,第三节 动物细胞产酶,早在1907年，美国
13、的Harrison在世界上首次将蛙的神经组织在试管内培养成功，建立起动物组织体外培养的第一块基石。1950年前后，Enders及其同事发表了第一篇关于在培养细胞中生长病毒的报告，开拓了以动物病毒为研究对象的新领域。作为大规模细胞培养，Copsik等人成功的进行了有关仓鼠肾细胞（BHK）的悬浮培养。随后，采用在培养液中添加人工合成的小球状惰性聚合体载体，大幅度提高了细胞的产量，并在10000升发酵罐内成功地进行深层培养。,随着基因工程技术的发展，人们逐渐认识到有许多基因产物不能在原核细胞内表达，它们需要经过真核细胞所特有的翻译后修饰，以及正确的切割、折叠后，才能形成与自然分子一样的功能和抗原性。
14、使得动物细胞一跃成为一种重要的宿主细胞，用以生成多种生物制品，例如病毒疫苗、淋巴因子（干抗素和白细胞介素等）、单克隆体、红细胞生成素、纤维蛋白溶酶原激活剂、第八因子、肿瘤坏死因子、上皮生长因子和过氧化物歧化酶等。这些采用大规模细胞培养技术生产贵重药品在临床诊断、治疗和预防等方面都有重要意义。,动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；生长速度缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生素；大多数哺乳动物需附着在固体或半固体的表面生长；对营养要求严格；大规模培养时，不可简单地套用微生物培养的经验。,动物细胞培养与微生物培养的不同点,大规模细胞培养的主要危险之一是微生物污染。设备、培养基、悬浮系统和操
15、作方法等的复杂性都易引起微生物污染，这是细胞培养都存在的一个普遍问题，在大规模培养更为严重。动物细胞生长十分缓慢，并易为大多数微生物污染物所破坏。支原体（mycoplasma）对动物细胞培养的威胁最大，因为其感染力强且不易检出。因此，大规模细胞培养成功的必要条件是要有一个设备精良的细胞库（cellbank）。在细胞库中的冷冻细胞不受污染。,动物细胞培养基的配方十分复杂，并且还需补充血清和蛋白胨。原料的质量控制和培养基的生产是大规模细胞培养的主要问题。因为血清来源困难，质量不稳定，残留血清给产物提纯带来困难等。虽然可采用无血清培养基，但在无血清培养基中更可能出现细胞毒。因此，与培养物相接触的水必
16、须采用高纯度的水。培养基一般需经膜过滤器过滤。可保证其无菌状态，但支原体也可被0.1m的过滤膜滤出。,目前，利用动物细胞培养的方法生产的有用产品大致可分为4大类：（1）疫苗 如狂犬病疫苗、麻疹疫苗和脊髓灰质炎疫苗等。（2）干抗素 如-干扰素和-干扰素等。（3）单克隆抗体 如抗绵羊红细胞单克隆抗体等。（4）遗传重组产品 如人生长激素、免疫球蛋白、胶原酶、尿激酶、纤溶酶原活化剂等。,1、动物细胞培养的特点（1）生长速率慢，易为微生物等污染，但可采用在培养基中加入抗生素等措施；（2）细胞个体大且无壁，对环境敏感，因此应慎重解决供氧（搅拌与通风）与细胞脆弱的矛盾；（3）设备放大是一新课题，不能完全按照
17、微生物反应过程的经验；（4）反应过程成本高，主要用于高附加值产物的生产。,2.培养基,动物细胞培养液的主要成分：,葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。,（1）液体培养基,（2）含有动物血清,动物体细胞大都生活在液体的环境,天然培养基合成培养基无血清培养基,3.培养方法(1)悬浮培养(suspension culture)瘤细胞、淋巴细胞(2)贴壁培养(anchorage-dependent culture)滚瓶培养、玻璃瓶、塑料瓶(3)贴壁悬浮培养(pseudo-suspension culture)微载体培养(microcarrier culture)葡萄糖凝胶（4）固定化培养包埋(
18、entrapment)和微囊(microencapsulation)培养 结团培养(aggregate culture),动物细胞培养,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,胰蛋白酶,（分解弹性纤维、胶原蛋白）,10代细胞,传代培养,无限传代,遗传物质改变,遗传物质未改变,.,归纳过程.,动物细胞培养过程,4.培养条件的影响与控制（1）温度：一般控制在36.5.（2）pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。（3）渗透压:应与细胞内渗透压相同。（4）溶解氧：根据情况随时调节。,典型动物细胞培养条件,无菌、无毒消毒、灭菌抗生素定期更换培养液，清除代谢废物营养合成培养基：糖、氨基酸、生长因子、无机
19、盐、微量元素（血清、血浆）温度和pH36.50.5，7.2-7.4气体95%空气，5%CO2,.植物组织培养的条件,.概念,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植物体,培养结果,获得细胞或细胞产物,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物细胞和动物细胞培养的比较,应用,.,.对比,鱼生殖腺单层细胞培养,1.细胞种类：人口腔上皮样癌KB细胞株；2.培养的天数：3d3.放大倍数：倒置显微镜高倍镜 放大40倍；4.培养基种类：1640+10%小牛血清；5.细胞状态与
20、特征简述:贴壁生长细胞，呈不规则形状；,1.细胞种类：ECV-304(脐静脉内皮细胞株)；2.培养的天数：3d；3.放大倍速：倒置显微镜 X100；4.培养基种类：1640+10%胎牛血清；5.状态与特征:细胞呈梭形，贴壁生长,内皮祖细胞,人脐静脉血管内皮细胞：1.细胞种类：原代内皮细胞；2.培养的天数：2d;3.放大倍数：倒置显微镜，20倍；4.培养基种类：M200；5.细胞状态与特征简述:细胞贴壁生长；,上皮样细胞型,成纤维细胞样细胞,正常组织细胞的培养,1.K562：人白血病细胞2.形态：悬浮细胞、规则、圆形3.培养条件：IMDM10FBS4mML-Glu4.每2到3天换一次液，5.大约
21、1x105cells/ml,1.细胞种类：小鼠骨髓瘤细胞;sp2/0 2.培养的天数：复苏后12小时；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：DMEM+6%FBS；5.细胞状态与特征简述:细胞呈圆型或椭圆形，贴壁生长。,不同时期动物细胞的生长状态,1.人微血管内皮细胞株（HMEC-1）2.培养的天数：1天3.放大倍数：10光镜4.培养基种类：10小牛血清DMEM培养基5.细胞状态与特征：多角型或梭型，边界清晰，大小均匀，胞核圆形或椭圆形，位于细胞中央，汇合后呈典型的铺路石样排列,1.细胞种类：人肝癌细胞株2.培养天数：传代后第2天；3.放大倍数：倒置显微镜 X40；4.培养基种类：1640+10%胎牛血清5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生长,BGC823：人胃腺癌细胞培养条件：DMEM高糖10FBS2mML-Glu,1.细胞种类：人胃肿瘤细胞SGC7901细胞2.培养的天数：4天；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清（杭州四季青）；5.细胞状态与特征简述:细胞呈梭型贴壁生长,1.细胞种类：猫角膜内皮细胞；2.培养的天数：2W3.放大倍数：倒置显微镜 200；4.培养基种类：1640+10%小牛血清（四季青）；5.细胞状态与特征简述:细胞高密度时呈36边形铺路石样生长,无菌操作台,倒置显微镜和25T培养瓶,
