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1、主要内容,概述细胞凋亡的形态学变化和生化改变细胞凋亡的过程与调控细胞凋亡的发生机制细胞凋亡在疾病防治中的意义,细胞凋亡（科普诗）,似秋叶的凋零，告别生命之辉煌；那难以计数的攻击、诱导，轻启着道道程序，逼细胞步步走向生命的末端；啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡;,危难中的细胞啊，你沉稳不乱，DNA片片切割，化云梯直通天堂；细胞体分团相聚，把生命的凝重浓集在小体上；分别了朝夕相处的伙伴，再见了快乐美好的时光；这一切的一切又融入临近的胞体，腾出的空间再写生命的篇章。2001，10，1 试作,一、概述,细胞凋亡(apoptosis)，是1972年由Kerr等建议用来描述
2、伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的变化形式的。“凋亡”一词来自希腊语，apo意为“分离”，ptosis指花瓣或树叶的脱落，“凋亡”是由这两个词组合而成，意指细胞凋亡的形态类似秋天花瓣或树叶的凋落一样,（一）细胞凋亡研究简史,1 凋亡概念的形成,2细胞凋亡的形态学及生物化学研究阶段：（1972-1987）1977年:人们注意到在生理或病理性刺激条件下，淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。1980年:Wyllie研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞凋亡变化，总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征，包括核固缩和DNA降解成寡核苷酸片段等3细胞凋亡的分子生物学研究阶段，最近几年1989年:0wen及其研究
3、小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中证明了信号传递物质对PCD的调控作用。1991年:Ellis首先发现了线虫(C.elegans)体内Ced-3、4两个基因与PCD的发生密切相关，随后逐渐发现了多种参与PCD的正相调节基因和负相调节基因4细胞凋亡的临床应用基础研究阶段细胞凋亡的研究，其生命力在于最终能够有利于疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。,2002年10月7日英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿，因在细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。他们不但发现在生物的器官发育过程中存在细胞程序性死亡，而且阐明了细胞程序性死亡过程中的基因规律。,Sydney B
4、renner,H.Robert Horvitz,John E.Sulston,THE NOBEL DIPlOMA,2002年诺贝尔医学与生理学颁奖仪式，瑞典斯德哥尔摩音乐厅。,Sydney Brenner receiving his Nobel Prize from His Majesty the King at the Stockholm Concert Hall.Photo:Hans Mehlin,Nobel e-Museum,（二）细胞死亡的方式,细胞坏死细胞凋亡细胞程序性死亡,1.细胞坏死(necrosis),是细胞受到急性强力伤害时立即出现的反应早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀溶酶体
5、破裂,细胞内容物流出,引起炎症,坏死,坏死炎细胞浸润,细胞凋亡的概念：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致 的细胞死亡过程 细胞凋亡的特点：细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体；凋亡小体内有结构完整的细胞器；溶酶体活性不增加 内切酶活化，DNA片断化，凝胶电泳图谱呈梯状,2.细胞凋亡(apoptosis),凋亡,3.细胞程序性死亡,细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是一种基因指导的细胞自我消亡方式。PCD和细胞凋亡的区别在以下方面：PCD是功能性概念，凋亡是形态学概念。大多数PCD的最终结果是细胞凋亡，但细胞凋亡并非都是程序化的。PCD存在于胚胎发育过程中
6、。,细胞凋亡与细胞坏死的比较(一),细胞凋亡与细胞坏死的比较(二),细胞凋亡的特征是细胞由于降解酶，主要是水解酶（蛋白酶与核酸酶）的作用，在近乎正常的细胞质膜内趋向死亡。这与坏死时细胞质膜早期破损不同。在细胞凋亡过程中，质膜脂双层丧失二侧不对称性，磷脂酰丝氨酸暴露于细胞表面，从而导致被吞噬。,（三）线虫(C.elegant)中的细胞程序性死亡,隐杆秀丽线虫（Caenorhabditis elegans,C elegans）低等蠕虫，虫体透明，易于观察体内细胞形态的变化。,线虫:成体959个细胞,但在发育过程中有131个细胞会注定发生PCDPCD发生时间:1h 左右参与线虫PCD的基因，目前已知
7、的有14个,Apoptosis is all around us,（四）生理性细胞凋亡的作用,确保正常发育、生长 在器官、组织的形成、成熟中发挥作用(细胞团 具备复杂结构的组织器官),多余细胞的清除,生理性细胞凋亡的作用,维持内环境的稳定 清除受损、衰老和突变的细胞(针对自身抗原T细胞的清除、子宫内膜周期性剥脱)发挥积极的防御作用,二、细胞凋亡的形态学变化和生化改变,微绒毛消失 脱水 空泡化(blebbing)固缩(condensation)出芽(budding)染色质边集(margination)凋亡小体(apoptosis body),（一）细胞凋亡的形态学变化,细胞首先变圆,随即与邻周细
8、胞脱离,失去微绒毛,胞浆浓缩,内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合,核染色质密度增高呈半月形,并凝聚在核膜周边,核仁裂解,进而细胞膜内陷将细胞自行分割为多个外有膜包裹、内涵物不外泄的细胞凋亡小体，被吞噬细胞或邻周细胞所识别、吞噬,或自然脱落而离开生物。不引起炎症反应和次级损伤。,apoptosis,凋亡时细胞的形态学改变,凋亡过程与调控,空泡化,固缩,出芽,边集,凋亡小体,形态学特征：,染色质边集,胸腺细胞,正常,凋亡,A comparison of normal and apoptotic T-cells.,胸腺细胞,正常,凋亡,（二）细胞凋亡的生化改变,DNA片断化,caspase激活,灭活凋亡
9、抑制物,水解活性蛋白,水解结构蛋白,1 DNA的片段化：梯状条带形成核小体连接区被切开：染色质,2 内源性核酸内切酶激活及其作用,由一系列胞内信号转导环节激活，执行染色质DNA切割,3 凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用,是一组对底物天冬氨酸部位有特异水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶（cysteine-containing aspartate-spicific protease）至少有13个成员,第一个被发现的caspase 是 caspase-1,即哺乳类的ICE(1992,1993),后来证明ICE与炎症有关而在细胞的死亡中没有明显作用。线虫的 CDE-3和ICE有一定的
10、同源性。,Caspase 8的激活，需要FADD(Fas associated protein with death domain)Caspase 9 激活，需要通过CARD（caspase-recruitment domain)、Apaf-1、细胞色素c、ATP等多个因子的参与。,细胞色素C、Apaf-1和pro-caspase 9 组成了“Apoptosome”（凋亡体）,caspases功能,灭活细胞凋亡的抑制物:正常活细胞因为核酸酶处于无活性状态，而不出现DNA断裂。这是由于核酸酶和抑制物结合在一起，如果抑制物被破坏，核酸酶被激活，DNA就会被降解，片段化。现知Caspase可以裂解这
11、种抑制物。水解蛋白质结构，细胞解体，形成凋亡小体如裂解核纤层，核纤层是由核纤层蛋白通过聚合作用形成的头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨架结构，是染色质得以形成并进行正常的排列。细胞凋亡时，核纤层蛋白被Caspase在一个近中部的固定位置裂解，从而使Caspase蛋白崩解，导致染色质的固缩。,在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白：使其获得或丧失功能如灭活或下调DNA修复有关的酶，mRNA剪切蛋白等。,三、细胞凋亡过程与调控,（一）细胞凋亡的过程,cAMPCa2+神经酰胺,凋亡诱因,凋亡信号转导,凋亡基因激活,细胞凋亡,凋亡细胞清除,受体,死亡信号,DNase活化 Caspases活化 DNA片断 凋
12、亡小体形成,巨噬细胞吞噬、分解,apoptosis,凋亡过程与调控,凋亡过程,受体,cAMPCa2+神经酰胺,凋亡相关基因激活,信号转导,细胞膜,细胞核,Dnase激活Caspases激活,apoptosis,凋亡过程与调控,凋亡过程,DNase激活,Caspases激活,凋亡细胞的清除,凋亡执行,（二）细胞凋亡的调控,1.细胞凋亡相关因素,诱导性因素,大量糖皮质激素淋巴细胞凋亡射线/高温/强酸/强碱/乙醇/抗癌药物CTL分泌粒酶HIVCD4+细胞凋亡,抑制性因素,细胞因子(IL-2/NGF),激素(ACTH/睾丸酮/雌激素),金属阳离子(Zn2+),药物(苯巴比妥/半胱氨酸酶抑制剂),病毒E
13、B病毒/牛痘病毒,凋亡信号转导系统特点,多样性：不同种类的细胞系统不同 偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶联 同一性：多因素，共用同一系统触发 多途性：同一诱导因素启动多条信号转导途径,2.细胞凋亡信号的转导,腺苷酸环化酶钙调素 Ca2+cAMP 谷氨酰胺转移酶 PKA 转录因子,神经酰胺 SPP AP-1 S期(抗凋),caspaseH1组蛋白,MAPK MAPKKRaf-1RasPTK,分化,PKC 二酰甘油,Tc-R,糖皮质激素,研究较多的系统：,依据：细胞凋亡时胞内游离Ca2+浓度显著上升用Ca2+载体A23187人为升高B淋巴细胞Ca2+水平，B淋巴细胞凋亡用Ca2+络合剂降低胞内C
14、a2+水平，阻止细胞凋亡,1胞内Ca2+信号系统（Ca2+为第二信使）,2cAMP/PKA信号系统（cAMP为第二信使）,依据：双丁酰cAMP可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺细胞凋亡糖皮质激素使cAMP上升cAMP激活PKA使靶蛋白某些氨基酸（苏、丝AA）残基磷酸化改变蛋白质功能,3Fas蛋白/Fas配体信号系统,Fas蛋白：细胞膜跨膜蛋白Fas蛋白+Fas配体（抗Fas）细胞凋亡机制：Fas蛋白+Fas配体（抗Fas）神经鞘磷脂酶活性产生神经酰胺蛋白激酶激活细胞凋亡Fas蛋白+抗Fas、TNF 激活ICE样caspase 降解H1组蛋白染色体松驰DNA暴露内切酶位点通过Ca2+信号系统传递死
15、亡信息引起细胞凋亡,Fas又称CD95，APO-1，是由325个氨基酸组成的受体分子配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物，Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域（DD,death domain）。死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白，它由两部分组成：C端（DD结构域）和N端（DED）部分。,FADD N端通过DED区（death effector domain）与无活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原结合，激活Caspase-8。进而引起随后的级联反应，即Caspases，,Caspase-8自
16、剪切活化，激活Caspase-3，Caspase-7Caspase-3激活Caspase-6。Caspase可降解结构蛋白、信号蛋白、转录调控蛋白、周期蛋白等等。Caspase还可降解CAD的调节蛋白，释放出CAD，CAD进入细胞核降解DNA。CAD 为caspase-activated Dnase，存在于胞质中。,死亡受体属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。目前至少发现有5种死亡受体，分别为 Fas,TNFR1,DR4,DR5,DR3。死亡受体通路是细胞凋亡的重要途径之一。它们位于细胞膜表面，具有相似的结构：细胞外有富含2-5个半胱氨酸的重复序列，并具有特异性地与其配体相结合继而诱导
17、凋亡的死亡信号激发域；胞内含有转导细胞凋亡信号必须的死亡功能区（death domain,DD），而且各成员的死亡结构域之间具有很高的同源性。对应于Fas和TNFR1的配体分别是FasL和TNF-DR4和DR5对应的配体是APO-2L，DR3的相应配体是APO-3L。,死亡受体,The combination of TNFR with TNF,死亡受体（FAS,TNFR,DR3，DR4，DR5）等，在死亡因子（FasL，TNF,APO-3L,APO-2L)等刺激下诱导凋亡。,1.(FasL-Fas)-FADD-caspase 8-途径。,2.(TNF-TNFR1)-TRADD-FADD-cas
18、pase 8-途径,3.(DR3L-DR3)-TRADD-FADD-caspase 8-途径,4.(APO-2L-DR4/5)-caspase 8-途径,死亡受体途径图解,4神经酰胺信号系统,神经酰胺：神经鞘磷脂（SM）在神经鞘磷脂酶的作用下产生的一类新型第二信使物质。介导细胞凋亡的依据：用天然神经酰胺处理u937白血病细胞，诱导细胞凋亡神经酰胺途径相关诱因：电离辐射、TNF-、Fas抗原、糖皮质激素,5二酰甘油/蛋白激酶C（PKC）信号系统,二酰甘油：磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶C催化下产生的一种第二信使物质。依据：活化的PKC1可诱导u937白血病细胞凋亡抑制PKC活性可抑制糖皮质激素诱
19、导的小鼠胸腺细胞凋亡,6酪氨酸蛋白激酶系统,生长因子或细胞因子激活酪氨酸蛋白激酶靶蛋白酪氨酸磷酸化Ras蛋白激活通过Raf-1、MAPKK、MAPK蛋白质磷酸化细胞分化生长因子或细胞因子撤除不能激活酪氨酸蛋白激酶系统细胞凋亡,（1）死亡基因：ced-3、ced-4、ced-9。Ced-3和 Ced-4的作用是诱发凋亡;Ced-9抑制Ced-3,Ced-4的作用,（三）凋亡相关基因,线虫细胞凋亡的基因,保守性高，在哺乳动物中相应同源物：Ced-3=ICE,ced-4=apaf-1,ced-9=bcl-2.,（2）吞噬基因：参与吞噬。ced-1、ced-2、ced-5、ced-6、ced-7、ce
20、d-8和ced-10。（3）核酸酶基因：nuc-1。（4）某些特殊类型细胞的死亡基因：ces-1、ces-2。,抑制凋亡基因：bcl-2促进凋亡基因：fas，P53,bax双向调控基因：c-myc，bcl-x,哺乳动物细胞凋亡的基因调控,1 Bcl-2：抑制凋亡基因,细胞凋亡抑制基因，名称来源于B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/Leukemia-2，bcl-2)。bcl-2能够编码 bcl-2（26KD）和 bcl-2（22KD）两种蛋白质，是膜的结合蛋白，主要存在于线粒体外膜、核膜及部分内质网中。,Bcl-2 和C.elegans 中的ced-9 有很高的同源性，Bc
21、l-2的功能是阻遏细胞凋亡 延长细胞的寿命，而不是刺激细胞的增殖,Bcl-2抗凋亡机制,直接的抗氧化抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质(细胞色素C、AIF)抑制促凋亡的Bax，Bak细胞毒作用抑制Caspases激活维持细胞钙稳态,线虫C.elegans 和哺乳类细胞的死亡途径比较,Bcl-2基因家族有众多成员，如Mcl-1、NR-B、A1、Bcl-w、Bcl-x、Bax、Bak、Bad、Bim等它们分别既有抗凋亡作用，也有促凋亡的作用Bax是Bcl-2家族中参与细胞凋亡的一个成员，当诱导凋亡时，它从胞液迁移到线粒体和核膜。可促进细胞凋亡多数成员间有两个同源区域，在介导成员之间的二聚化过程中起重要作
22、用。Bcl-2成员之间的二聚化是成员之间功能实现或功能调节的重要形式。,Bcl-x由于mRNA剪接方式不同，可产生两种大小不同的Bcl-x分子：Bcl-xL和Bcl-xS大分子Bcl-xL含有两个保守的同源区(BH1,BH2)，和Bcl-2相似，可以抑制细胞凋亡小分子Bcl-xS缺少两个保守的同源区，促进细胞凋亡,2 Bcl-x：双向调控基因,3.c-myc：双向调控基因,c-myc是调控细胞周期的主要基因之一。Myc蛋白是一种转录因子，其氨基端具有反式激活结构域，羧基端具有螺旋环螺旋亮氨酸拉链结构域，介导聚合与特异的DNA序列结合。c-myc基因表达在与其它致癌因素同在时为增殖作用，与其他抑
23、癌因素共存时，就反过来导致细胞死亡。,4 Fas-细胞表面受体，跨膜蛋白，伸向胞浆部一段与TNF受体相似（高度同源）；Fas抗体诱导凋亡（模拟配基作用、启动）,死亡受体介导的信号途径,mFasL:cell-membrane-bound FasL,sFasL:soluble FasL,死亡受体（FAS,TNFR,DR3，DR4，DR5）等，在死亡因子（FasL，TNF,APO-3L,APO-2L)等刺激下诱导凋亡。,1.(FasL-Fas)-FADD-caspase 8-途径。,2.(TNF-TNFR1)-TRADD-FADD-caspase 8-途径,3.(DR3L-DR3)-TRADD-FA
24、DD-caspase 8-途径,4.(APO-2L-DR4/5)-caspase 8-途径,死亡受体途径图解,5 P53-野生型诱导凋亡，在G1期发挥卡点功能有缺陷DNA启动修复失败启动凋亡P53=molecular policeman,A model for the function of p53,G1,S,G2,M,Cyclin A+CDK,Cyckin A+CDK1,Cyclin B,Cyclin D,p53,Bax,+,Bcl-2,molecular policeman?,Blocking IGF+R,四、细胞凋亡的发生机制,1 氧化损伤 活性氧氧化损伤生物大分子形成氧化应激,机制：,
25、1972年,Demopoulos证实了氧自由基(oxygen free radical,OFR)在脑缺血中对内皮细胞损伤起重要作用,目前越来越多的证据表明 OFR参与了细胞凋亡的发生.自由基及氧衍生自由基是具有未配对电子的原子、原子团及分子，是参与人体内氧化还原反应最重要最广泛的反应成分。,氧自由基,DNA损伤P53活化聚ADP核糖转移酶，引起NAD耗竭，ATP膜损伤：过氧羟基24碳四烯酸诱导激活Ca 2+/Mg 2+依赖的核酸内切酶 膜透性，Ca 2+内流 活化Fas，加速凋亡相关基因表达,氧化诱导细胞凋亡的机制及其调节,2.钙稳态失衡TNF，抗CD3抗体 引起细胞凋亡是钙依赖性过程,钙稳态
26、失衡引起凋亡的机制：,激活Ca2+/Mg 2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链 激活谷氨酰胺转移酶，酰基转移，细胞骨架蛋白分子间交联，凋亡小体形成 激活与凋亡有关的核转录因子 Ca 2+促使核小体间酶切位点暴露,3 线粒体损伤线粒体是真核细胞的重要细胞器，是动物细胞生成ATP的主要地点。线粒体基质的三羧酸循环酶系通过底物脱氢氧化生成NADH。NADH通过线粒体内膜呼吸链氧化。与此同时，导致跨膜质子移位形成跨膜质子梯度和/或跨膜电位。线粒体内膜上的ATP合成酶利用跨膜质子梯度能量合成ATP。合成的ATP通过线粒体内膜ADP/ATP载体与细胞质中ADP交换进入细胞质，参与细胞的各种需能过程。,超微结
27、构基本正常，功能明显下降：线粒体内膜通透性增大，且跨膜电位（m）下降，能量合成明显,线粒体损伤,(1)线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系,近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。,(2)线粒体通透性转变孔道,在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于线粒体内、外膜之间的由多个蛋白质组成的通透性转换孔(permeability transition pore,PTP)开放PT孔道有开放与关闭二种构象。PT孔道开放导致细胞凋亡。而PT孔道关闭能防止细
28、胞凋亡。凡是能够专一作用于线粒体诱导PTP生成的物质，例如苯并二嗪受体的配基原卟啉IX等都能引起细胞凋亡。,诱导因素跨膜电位（m）PTP开放通透性凋亡,（3）启动因子（细胞色素C，Apaf，AIF）的释放,cyt C是电子传递链复合物III的一个组分，由核基因组编码，定位于线粒体内膜的外侧。当细胞受凋亡信号刺激后，cyt C从线粒体释放到胞质中，经级联放大作用，形成caspase 9-caspase 3 活化复合物（凋亡体），最终引起细胞凋亡。,Caspase 9 激活，需要通过CARD（caspase-recruitment domain)、Apaf-1、细胞色素c、ATP等多个因子的参与。
29、,细胞色素C、Apaf-1和pro-caspase 9 组成了“Apoptosome”（凋亡体）,PTP-permeability transition poreApaf-apoptosis protease activated factorCyt.C-cytochrome CAIF-apoptosis inducement factor,细胞凋亡的恶性网络假说,线粒体 m PTP开放 Apaf+Cyt.C,AIF,Caspase抑制剂,+,Caspase 9酶原,Caspase-9,Caspase3酶原,Caspase-3,蛋白质水解,无活性核酸内切酶,内切酶激活,DNA断裂,+,+,+,Bcl-2,Ca2+,apoptosis,？,氧化损伤,钙稳态失衡,线粒体损伤,恶性网络假说(deleterious network hypothesis),细胞凋亡,m,AIF，Apaf,PTP open,本章目的要求,1.掌握细胞凋亡的相关概念及英语词汇2.掌握细胞凋亡的形态学改变、生化改变、过程、发生机制。3.熟悉细胞凋亡信号传导通路特别是Fas通路4.熟悉凋亡相关基因,
