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1、细菌的染色和细菌细胞构造的观察,目的要求染色剂和染色的原理实验材料实验程序思考题,目的要求,学习微生物涂片掌握细菌的一般染色发和革兰氏染色 进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术 观察和识别细菌细胞的特殊构造,染色剂和染色原理,微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素如：正负离子之间的相互吸引等染色剂 染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型：1.酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。2.碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。3.中性（复合
2、）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。4.单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b)的染料。,染色剂和染色原理,微生物染色常用染料如下表：,实验材料,涂片染色用的细菌培养物.大肠杆菌（Escherichia coli)24h的斜面培养物。.枯草杆菌（Bacillus subtilis)1216h的斜面培养物。载玻片、接种环、镊子、酒精灯、各种染色液、火柴、无菌牙签、玻璃铅笔、蒸馏水。显微镜、镜头油、擦镜纸、吸水纸、二甲苯等。示范片.苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensi
3、s）的芽孢；.胶质芽孢杆菌（Bacillus mucillaginosus）的荚膜；.枯草芽孢杆菌的鞭毛。,实验程序（细菌染色的方法和步骤）,细菌染色的方法:.单染色法：用一种染色液染菌体后，就可以观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。.复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法、细胞染色法等。染色技术的一般过程 涂片干燥固定染色媒染脱色复染水洗干燥镜检,实验程序（简单染色的方法和步骤）,简单染色法（一般染色法）.菌种：牙垢细菌.涂片.干燥：自然
4、气干或酒精灯高处微微加热。固定.染色：在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色分钟。.水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。干燥：空气中自然干燥。镜检：在油镜下观察牙垢中的各种细菌形态并绘图。,实验程序（革兰氏染色的方法和步骤）,革兰氏（Gram）染色法 1.涂片 2.初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4.脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗。5.复染：滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。6.镜检：观察染色结果并绘图。,
5、实验程序（荚膜染色的方法和步骤）,荚膜染色法（示范）：荚膜薄，易变形，因此在涂片过程中不能用加热固定。1.取斜面培养72h左右的胶质芽孢杆菌涂片，自然干燥，自然固定。2.染色：在已自然晾干的涂面上，滴加1%结晶紫染色液染色2min，以20%硫酸铜冲洗数次，再用自来水冲洗1次，晾干。3.镜检：油镜观察示范片并绘图（菌体红色，荚膜无色）。,实验程序（鞭毛染色的方法和步骤）,菌液的制备及涂片：菌种应预先连续传代56代。1.接种：先在斜面底部加入0.51mL无菌水，取活化的枯草杆菌12环菌苔，接种于无菌水中，300C 培养1518h。2.制备菌液：挑取斜面底部近水面处菌苔数环，移入1mL与菌种同温的无菌水中，在280C温箱中保温10min。3.鞭毛涂片：先用悬滴法观察其运动性，若运动性很强，即可涂片。涂片后自然干燥、固定。染色：染色液必须新配制，涂片必须充分晾干才能染色。1.先用刚过滤的鞭毛染色液A染7.58min左右。2.倾去A液，再加鞭毛染色液B液染35min，水洗，自然干燥。.用液石炭酸复红复染min，水洗、晾干、镜检。油镜下观察鞭毛的数目及着生情况（示范镜）并绘图（菌体与鞭毛都呈红色，周生鞭毛）。,录像演示,思考题,简单染色法中各步骤的注意事项是什么？要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键在哪几步？为什么？,实 验 二,结 束,
