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1、目的,本试验是一项检测生殖细胞染色体畸变效应试验，利用细胞遗传学方法，检测整体哺乳动物初级精母细胞染色体畸变，以评价受试样品引起生殖细胞可遗传突变的可能性。学习小鼠初级精母细胞染色体畸变试验方法的基本操作步骤。,原 理,不同发育阶段的雄性生殖细胞对化学物质的敏感性不同，初级精母细胞对化学诱变剂较敏感。多数情况下，化学诱变剂诱发染色体畸变必须经过DNA复制期。哺乳动物精子发生过程中，DNA合成是在初级精母细胞细线期以前的各阶段细胞中进行，以后孵育的细胞不再进行DNA合成，故受试物需在前细线期给予。于小鼠第一次接触受试物后的第1214天采样制片，可观察到前细线期接触引起的精母细胞染色体畸变效应。,
2、仪器和器械,生物显微镜、离心机、解剖剪、眼科镊子、注射器、灌胃针头、小平皿、离心管、吸管、滴管、试管架、载玻片、玻璃染色缸、擦镜纸等。,试剂,姬姆萨（Giemsa）染液 Giemsa染料3.8 g 甲醇 375 ml 甘油 125 ml 配制：将Giemsa染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375 ml，待完全溶解后，再加入125ml甘油，混合均匀。置37恒温箱中保温48h。保温期间振摇数次，促使染料的充分溶解。取出过滤，两周后使用。,试剂,0.04%秋水仙素：置于棕色瓶中，冰箱保存;低渗液：1%柠檬酸三钠溶液;1%枸橼酸三钠溶液；0.4KCL,300ml 60%冰乙酸:临用时现配,
3、100ml 固定液:甲醇与冰醋酸以3:1混合，临用时现配,400ml;,试剂,磷酸盐缓冲液（pH 6.8）12水磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.81 g（磷酸氢二钠：4.74g）磷酸二氢钾（KH2PO4）4.50 g 加蒸馏水至 1000 mlGiemsa应用液:取1份Giemsa染液与9份1/15mol/L 磷酸盐缓冲液混合而成，临用时配制。,试验设计,实验动物 712周龄健康雄性小鼠，每组保证至少5只存活剂量分组阴性对照组 溶剂阳性对照组 丝裂霉素C 1.52mg/kg 腹腔注射一次；或环磷酰胺40mg/kg，腹腔注射，1次/d，连续5天。,试验设计,剂量组 高剂量 根据急性LD50，选
4、用使动物轻 微中毒，体重略有下降，不引 起动物死亡的剂量 按等比级数2向下设置中、低剂量组,接触途经 与实际接触途经一致或接近，可一次接触，也可每天接触一次，连续5天的方法。取样时间 各组均于第一次接触后第1214天将动物处死采样。,操作步骤,1、注射秋水仙碱 动物处死前6h腹腔注射秋水仙碱4mg/kg（0.04，0.1ml/10g）2、动物处死 颈椎脱臼处死小鼠，取两侧睾丸，去净周围组织和脂肪，放入盛有适量低渗液的小平皿中，洗去毛和血污，转入另一小平皿中。,3、低渗 用眼科镊撕开睾丸被膜，轻轻分离曲细精管，加低渗液10mL，用滴管吹打混悬曲细精管，室温下低渗2040min（低渗时间依室温条件
5、而定）。4、固定 仔细吸净低渗液，加固定液10mL，固定20min。必要时可存放在冰箱中过夜，但软化前应将固定液吸掉，再加入新鲜固定液，固定10min。,5、软化 吸净固定液，加60冰醋酸2mL，滴管吹打至不透光，立即加入4mL固定液，用滴管打匀，移入离心管，以1 000r/min离心10min。6、制片 弃去大部分上清液，留下约0.51mL，充分打匀制成细胞悬液。将细胞悬液均匀地滴于冰水玻片上，轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上。每个睾丸制片23张。空气干燥或微热烘干。,预冷的玻片,滴片,7、染色 将制备好的标本片放入Giemsa应用液中染色2030min。立即用蒸馏水或磷酸盐缓冲液冲洗。晾干。8
6、、读片 在低倍镜下按一定顺序寻找背景清晰、分散良好、染色体收缩适中的中期分裂相细胞，再在油镜下选取邻近无游离染色体或中期相的细胞进行观察。,9观察 每只动物分析100个中期分裂相细胞。（1）裂隙、断片、缺失、微小体、环状染色体、整倍体和非整倍体改变等。（2）相互易位 涉及非同源染色体间末端断片的交换，需要两次断裂和修复。（3）X-Y和常染色体的单价体,统计学方法：受试样品组与对照组的断片、易位、畸变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等分别按X2检验或Kastenbaum 和Bowman所述方法进行统计分析。阳性：受试样品组染色体畸变率与阴性对照组相比，统计学意义上有显著性差异，并有明显的剂量反应关系或在一个受试样品组出现染色体细胞畸变数明显增高。若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系，则须进行重复试验，结果能重复者可确定为阳性。,结果评价,小白鼠的染色体分裂相（2n40）,小白鼠的染色体,
