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1、实验用品,一、材料和标本 培养中的几种细胞。二、器材和仪器 倒置显微镜、细胞计数板、普通光学显微镜、乳头吸管。三、试 剂 0.3%台盼兰染液等,实验内容,一、培养细胞的形态观察(一)原理体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细胞,如内皮细胞,叫贴壁型细胞。体外培养的细胞绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞-并不贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长，如 HL-60,叫做悬浮型细胞,这类细胞主要是血液原性或癌原性的细胞。,(二)操作1.从培养箱中取出细胞培养瓶,注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。然后,将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上。2.打开倒置镜光源,通过双筒目镜将
2、视野调到合适的亮度。3.调节载物台的高度进行对焦,在看到细胞层之后,再用细调节器将物像调清楚,注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时，最经常使用的是10物镜。,（三）结果贴壁细胞一般有两种形状,即上皮细胞形和成纤维细胞形细胞。上皮细胞形细胞呈扁平的不规则多角形,圆形核位于中央,生长时常彼此紧密连接成单层细胞片,如HeLa 细胞。成纤维细胞形细胞形态与体内成纤维细胞形态相似,胞体呈梭形或不规则三角形,中央有圆核,胞质向外伸出23个长短不同的突起,细胞群常借原生质突连接成网,如 NIH3T3。,贴壁细胞在生长状态良好时,细胞内颗粒少,看不到有空泡,细胞边缘清楚,培养基内看不到悬浮的细胞和碎片
3、,培养液清澈透明,而当细胞内颗粒较多,透明差,空泡多时,表明生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌或真菌污染的可能。悬浮细胞当边缘清楚,透明发亮时,生长较好；反之,则较差或已死亡。,由于培养基内有pH指示剂的存在,因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时,则可能是培养时间过长,营养不足,死亡细胞过多；如呈紫红色,则可能是细胞生长状态不好,或已死亡。一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的,它随营养、pH、生长周期而改变,但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。在贴壁细胞培养中,镜下折光率高,圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的特征
4、。,二、培养细胞的计数及活细胞的鉴定,（一）原理细胞生物学的实验中,往往要进行活细胞的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度,是进行实验必不可少的一种基本技能。,（二）操作,1.将培养瓶中的培养液倒人干净试管中,向培养瓶中加入 0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1.0m1,静置35分钟,待见到细胞变圆,彼此不连接为止。2.将试管中的培养液倒回培养瓶中,并轻轻进行吹打,制成细胞悬液。,3.取细胞悬液0.5m1,加入0.3%台盼兰染液0.5ml时,混合后染色 35 分钟。4.滴加少许已染色的细胞悬液于放有盖片的细胞计数板的斜面上,使液体自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生,否则要重新滴加。在普通光镜10物镜下计数四个大格内(如图1，2 示)的细胞数,压线者数上不数下,数左不数右。,（三）结果,细胞浓度计数4大格细胞总数104稀释倍数/4=细胞数ml（4大格中细胞总数染色细胞）104稀释倍数/4=活细胞数ml悬液 注 4大格中的每一大格体积为0.l mm3。1ml10000大格，因此，1大格细胞数104 细胞数ml。注 染色标本在15分钟内检查计数，因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞染上兰色，延长时间活细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。,作业,1.总结培养细胞生长观察方法。2.将你计数的每毫升细胞悬液中的细胞总数，死、活细胞的百分比例计算出来。,
