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1、一、实验目的,了解革兰氏染色法的原理，学习并掌握革兰氏染色方法。,二、实验原理：,细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。常用碱性染料进行简单染色，这是因为细菌的等电点较低，约在pH 25之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）等结合，使细菌被染成紫色或红色。,革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细
2、菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。,G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫-碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，因此细菌仍保留初染时的颜色紫色。,三、实验仪器及材料,1.仪器：显微镜、酒精灯等 2.实验材
3、料：菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 染色剂：草酸铵结晶紫染液、碘液、番红、95%乙醇,四、实验内容与步骤,革兰氏染色流程图,涂片 干燥 结晶紫染色碘液媒染 水洗 95%酒精脱色 水洗 番红染色 水洗 晾干 镜检,固定,水洗,1涂片 取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。2干燥 涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。,
4、3固定 固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过23次，共约23秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60）,放置待冷后，进行染色。,4初染 用草酸铵结晶紫染色1-2min后倾去染液，水洗至流出水无色。5、媒染 先用碘液冲去残留水迹，再加碘液覆盖媒染1min后水洗。6脱色 斜置载玻片，滴加95乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时2030s，随即水洗。,7复染 将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红染液复染1min，水洗，吸去残水晾干。8、镜检 待标本片置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果。9.混合涂片染色,注意事项：,1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色 过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性 菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被 染成革兰氏阳性菌。2.菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡 或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。3.不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。,五、实验结果：,紫色菌：革兰氏阳性菌,红色菌：革兰氏阴性菌,六、思考题,1、造成革兰氏染色结果不正确（假阴性或假阳性）的主要原因有哪些？2、你认为革兰氏染色法中那个步骤可以省略？在什么情况下？,
