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1、一、实验目的,通过细菌质粒DNA的提取，掌握共价闭合环状DNA的提取方法。,二、实验原理,细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。,三、实验菌株,含质粒载体pGEM-T的大肠杆菌（E.coli.）,四、实验用具和药品,实验用具摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（15mL）及塞子、离心管（1.5mL）。,
2、实验药品,五、实验步骤,方法：活化-扩增-离心-裂解-离心-抽提-沉淀-洗涤-溶解（一）细菌繁殖实验前2天晚上：将冻存的菌株取出，划线接种于LB（amp）平板上，置于37培养箱中，倒置培养至菌落长成。实验前1天晚上：从LB平板上挑取单个菌落，接种于6mlLB液体培养基（加入氨苄青霉素）中，37，过夜振荡（200r/min）培养。,（二）菌体收集实验当天：将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，5000r/min离心2min；弃上清,（三）碱裂解法提取质粒DNA 全套操作约需1小时，详细说明如下。3.加入250 l的Solution（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。注）注意不要残留细小菌块，
3、可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。4.加入250 l的Solution 轻轻地上下翻转混合56次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。注）此步骤不宜超过5分钟。5.加入400 l的4预冷的Solution，轻轻上下翻转混合56次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟。6.室温12,000 rpm离心10分钟，取上清。注）此时4离心不利于沉淀沉降。7.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube 上。8.将上述操作6的上清液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。,9.将500 l的Rinse A加入Spin Colum
4、n中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。10.将700 l的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。11.重复操作步骤10。12.将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000 rpm离心1分钟。13.将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入60 l的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60使用时有利于提高洗脱效率14.12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。,六、实验作业,按上述
5、实验步骤提取质粒DNA。思考本实验的关键步骤是什么？答：本实验的关键是溶液重悬须充分，溶液混合须温和。,实验二 大肠杆菌的遗传转化,一、实验目的,通过实验了解原核生物实现基因转移的途径，掌握质粒DNA遗传转化的基本原理和操作方法。,二、实验原理,转化（transformation）是指一种生物由于接受了另一种生物（或同种生物）的遗传物质，从而获得了后者的某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。用理化方法人工诱导细菌进入感受态的操作叫致敏过程。目前应该较广的转化方法有两种：CaCl2转化法（化学转化法）和电转化法。CaCl2转化法的原理是在低温（0）和低渗
6、的CaCl2溶液中，菌体膨胀，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细菌细胞表面，经42短时间热击，促进细胞吸收DNA复合物。,三、实验材料,质粒pGEM-T easy：编码氨苄青霉素（Ampr）的抗性基因大肠杆菌（E.coli）DH5菌株：氨苄青霉素敏感型（Amp-）,四、实验用品,超净工作台、摇床水浴锅、离心机分光光度计、移液器及枪头三角瓶（500mL、200mL）离心管（50mL、1.5mL）平板（Ampr、Amp-）、LB培养基冰冷的CaCl2溶液、质粒DNA,0.1M CaCl2溶液配制：称量1.11g无水CaCl2固体，溶于1000ml双蒸水中，高压灭菌或0.
7、22um滤器过滤除菌。保存于4度冰箱中。质粒的提取：利用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。,五、实验步骤,（一）感受态的制备(此步骤已完成）1、E.Coli涂布于平板（Amp-），37，培养12h；2、挑取单菌落，转移至盛有200mL LB的500mL三角瓶中，37，振荡（200r/min）培养12h；,3、吸取1mL菌液，转移至盛有100mL LB的200mL三角瓶中，37，振荡（200r/min）培养23h，每隔0.5h测OD600值；4、当OD600=0.30.4（对数生长期的OD600=0.6）取出；冰上放置1060min；5、4，5000rpm，离心10min，弃上清；6、冰预冷的0.1
8、mol/L CaCl2 10mL悬浮细胞；7、冰上放置15min；8、4，5000rpm，离心10min，弃上清；9、冰预冷的0.1mol/L CaCl2 2mL悬浮细胞；10、用于转化实验；若需保存，加入终浓度15%的甘油，-70保存。,（二）转化（冰上操作）1、1.5mL管中加入感受态细胞50L和待转化的质粒2L，冰浴30min；2、42热击90sec（勿晃动管子）；3、冰浴2min；4、加入37预热的LB至1mL；5、37，振荡（50r/min）培养2h；6、取200L涂板（Ampr），37培养12-16h；7、对生长出的白色菌落计数，计算出每微升质粒的转化率。,六、实验作业,计算出大肠
9、杆菌的转化率，转化率=平板上的白色菌落数2L。转化过程中，会不会出现假阳性的结果，为什么？如何排除？答：转化过程中，经常出现假阳性。原因很多，如质粒、菌株不纯，载体自连等。详细的解释见分子遗传学。,准备工作,1、培养板和菌株准备实验前2天：制备LB液体培养基，LB固体培养基（含amp）若干（每组一个LB平板）、灭菌TEbuffer（或双蒸水）将冷冻的pGEM-T载体菌株取出，划线接种至LB平板（amp）。培养前1天，培养18-24h后，挑单菌落接种至LB液体培养基（含amp）。若需制备感受态，时间同上，另需准备LB平板。2、0.1mol/L CaCl2 需提前配制，高压灭菌。氨苄青霉素工作浓度50ug/ul，一般是每ml培养基加入1ul氨苄青霉素。3、制备碎冰，用于冰浴4、eppendorf管、枪头（蓝、黄、白）、试管进行灭菌处理5、移液器：实验室的50-250ul移液器6、42度水浴锅、恒温摇床,
