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1、病理学技术,病理技术是病理学的一个重要分支，是病理学研究中的方法学，是病理诊断的基础。常规病理是病理技术最重要的部分，任何病理诊断离不开它。,病理学技术,分类：常规病理（HE染色）特殊染色（三色法、银染、糖原染色等）免疫组化细胞制片分子诊断技术电镜技术,重点介绍：常规病理：原理、操作步骤、质量控制。,病理学技术,第一部分,原理及操作步骤,病理学技术,固定fixation,脱水dehydration,染色staining,包埋embedding,切片sectioning,病理技术工作环节,封片Coverslipping,病理学技术,固定（fixation）：概念:用甲醛等化学试剂对标本进行浸泡处
2、理，使组织和细胞保持与离体前相仿。,病理学技术,固定（fixation）：目的:保持细胞与生活时的形态相似，防止自溶与腐败。保持细胞内特殊成分与生活状态时相仿，如细胞内一些蛋白质可以沉淀和凝固，使其定位于原位，有利于后期定位。组织中不同物质固定后，产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。,病理学技术,固定（fixation）：目的:硬化作用能使柔软组织（如脑）的质地变硬而易于操作。固定能使细胞正常的半液体状（溶胶）变为不能逆转的固体状（凝胶）粘度。,病理学技术,固定（fixation）：操作方法:临床科室切取的标本置放于含固定液的容器中固定，送检病理科。固定液体积为标本体
3、积的4-5倍。病理科收到标本后取材，上脱水机。,病理学技术,固定（fixation）：注意事项:常规固定液为10%中性福尔马林液。小标本的固定时间为46小时，大标本为1824小时或更久。,渗透力强固定均匀对标本影响小,病理学技术,常用的固定液：4%中性甲醛（10%中性福尔马林）固定液 甲醛（40%）5000ml磷酸氢二钠182.5g磷酸二氢钠13.5g氯化钠380g蒸馏水45000ml 此液固定效果比单纯10福尔马林要好,病理学技术,脱水（dehydration）：目的:用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。还可以使组织再次发生一定的硬化。脱水剂必须是与水在任何比例下均能混
4、合的液体。,病理学技术,脱水（dehydration）：原理:用不同浓度的乙醇将组织中的水分替换出来。,病理学技术,脱水（dehydration）：原理:再用纯二甲苯将组织中的乙醇成分替换出来。-透明 用已经融化了的石蜡将组织中二甲苯成分替换出来。-浸蜡,病理学技术,脱水（dehydration）：操作步骤,病理学技术,脱水（dehydration）：,并不是所有标本都适用于这个脱水程序！标本的大小及性质决定了脱水时间！特殊标本在脱水之前要特殊处理！（如脱钙）,脱水的质量控制：1、脱水试剂定期更换2、石蜡定期更换3、脱水机保养4、适用于本实验室的脱水程序,脱水机试剂的更换方法,每天更换一次,每
5、周更换一次,每周更换一次,每周更换一次,每周更换一次,每周更换一次,更换的试剂向后移,更换的试剂向后移,更换的试剂向后移,更换的试剂向后移,病理学技术,脱水（dehydration）：脱水机,病理学技术,组织切片技术(按包埋方法分)明胶包埋法火棉胶包埋法碳蜡包埋法塑料包埋法冰冻切片法石蜡包埋法最常用的方法是石蜡包埋法。,4、包埋,石蜡包埋法：利用石蜡的硬度，以石蜡包埋组织，制成石蜡切片。,在组织学实验室，一般使用两种石蜡：一种是55石蜡，用于脱水程序中的石蜡浸泡。一种是60石蜡，用于石蜡包埋，制成石蜡切片。,病理学技术,包埋（embedding）：目的及原理:将脱水浸蜡好的标本按一定规律放在大
6、小不等的包埋模具里，加已经溶解的石蜡固定好，冷却。以便于下一步的切片制作。,病理学技术,包埋（embedding）：目的及原理:脱水机和包埋机里的蜡都是经过加热溶解的，温度在60左右，呈液态。将组织放在包埋模里，加蜡填充后冷却，呈固态。有利于切片。,包埋的步骤,首先从包埋机中把熔化的石蜡注入合适包埋模具中（包埋模具分大、中、小三种）；用加温预热好的眼科镊子将已经过浸蜡的组织块按一定原则（见包埋注意事项）放入包埋模具底面的中央处，再将包埋模具移到冷冻台冷冻片刻。立即将与组织块相应病理号的脱水盒放于包埋模具上，并从上面注入足够的石蜡，将包埋模具连同脱水盒一起移至包埋机的冷冻台；待包埋模具内的熔蜡表
7、面凝固后，即将模具移到冰块上加速凝固；从包埋模具中取出凝固的包埋蜡块（简称蜡块），待放冰箱准备切片。,病理学技术,包埋（embedding）：,病理学技术,包埋（embedding）：,病理学技术,切片（sectioning）：目的及原理:将包埋好的组织块用切片机切成一定的厚度，一般切成46m。淋巴组织丰富的标本如淋巴结、鼻咽组织等应尽量薄切。,病理学技术,切片（sectioning）：目的及原理:常用的切片机有轮转式、平推式的。用轮转式的易于切出连续切片。切片厚度随制片目的而调整。,病理学技术,切片（sectioning）：操作步骤:,科室现有的几种切片机,病理学技术,染色（staining
8、）：目的及原理:借助于一种或多种染料，使组织和细胞内结构分别着不同的染色，这样在显微镜下能清楚地观察细胞内部结构。常规染色（HE染色）是目前运用最广泛的染色之一。此外还有如：VG染色、Masson染色、PAS染色属于特染范围。,病理学技术,染色（staining）：目的及原理:HE染色：包含苏木素和伊红两种染料。苏木素染细胞核，伊红染细胞浆。,病理学技术,染色（staining）：目的及原理:原理包括物理和化学的作用。一般认为细胞核带负电荷，呈酸性，易与带正电荷的苏木素碱性染料结合而形成蓝色；细胞浆内主要的成分是带正电荷蛋白质，易与带负电荷的伊红染色结合染成红色。,病理学技术,染色（stain
9、ing）：细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。,病理学技术,脱蜡1、二甲苯（AR）5分钟2、二甲苯（AR）5分钟 3、100%酒精（AR、无水乙醇）1分钟4、100%酒精（AR、无水乙醇）1分钟5、95%酒精（工业酒精或医用酒精）1分钟6、80%酒精（工业酒精或医用酒精）1分钟7、自来水浸洗 1分钟染色1、苏木素染液 6分钟2、水冼 1分钟3、0.5-1%盐酸酒精分化 片刻（上下三次、颜色由蓝变红）4、自来水
10、冲冼 15分钟以上5、0.5%伊红浸染 12分钟6、水洗 1分钟脱水、透明、封固95%酒精 1分钟95%酒精 1分钟100%酒精 1分钟100%酒精 1分钟石炭酸二甲苯(1:5)10秒钟二甲苯 透明 1分钟二甲苯 透明 1分钟二甲苯 透明 1分钟染色结果：核：蓝黑色 胞浆：不同程度的粉红色 肌纤维：较深的粉红色 胶元纤维：淡红色 红细胞：桔红色。,操作步骤,染色注意事项,二甲苯脱蜡时间冬季长些，夏季可短些，为防止脱蜡不净影响染色，脱蜡时间宁长勿短。盐酸酒精分化时间灵活掌握，可以在切片蓝化后镜下观察。染色后的脱水透明也很重要，若脱水不完全，切片会模糊不清，脱水的乙醇要保持纯度，切片在进入脱水乙醇
11、前尽量把水份去掉。HE染色虽是常规染色，但是要制出一张完美的HE切片并不是易事，需要实际操作人员在染色过程中认真控制。在染色的每一步骤都应仔细观察片子的情况，如在染了苏木素并分化后，就可以在显微镜下观察细胞核的着色情况，在其它的步骤中，也可以用肉眼或镜下作仔细观察。,染色常见问题及排除,病理学技术,封片（Coverslipping）：目的及原理:将组织切片封固保存于载玻片与盖玻片之间，使之不与空气发生接触，防止其氧化、褪色，利于镜检观察及保存。通常使用中性树胶封片。,病理学技术,封片（Coverslipping）：目的及原理:中性树胶为浅黄色油状液体，透明度高，折光率近似玻璃，并呈中性，溶于二
12、甲苯，不溶于水，可使切片标本封藏后观察得更为清晰，长期保存不褪色。,病理学技术,封片（Coverslipping）：操作步骤:,病理学技术,阅片,第二部分,质量控制,病理学技术,脱水,包埋,染色,切片,病理技术环节的质量控制,病理学技术,质量控制（quality control）：标本处理和保存原则:1、新鲜标本立即投入固定液中固定。2、常规固定液为10%福尔马林液。3、固定液的量应充分，一般应为标本体积的 4-5倍4、切取的组织块大小约为1.5x1.5mm2，厚度约为3mm。过大或过厚则会影响组织处理。,病理学技术,质量控制（quality control）：脱水的质量控制:1、脱水试剂定期
13、更换2、石蜡定期更换3、脱水机保养4、适用于本实验室的脱水程序,病理学技术,质量控制（quality control）：包埋的质量控制：1、按正确的程序包埋2、防止交叉污染3、防止组织混淆,病理学技术,质量控制（quality control）：切片的质量控制：1、组织面要切全2、厚薄适中3、切片平整，避免皱折4、注意换刀，避免有刀痕5、捞片时防止污染6、贴片位置合适、美观,病理学技术,图例,病理学技术,总结：制作一张高质量的病理切片的影响因素：1、技术人员的技术能力与责任心2、组织前期处理：固定、脱水等因素3、取材的质量,病理学技术,提问环节：问题：1.常用的固定液是？2.脱水用的试剂一般有？它们之间的关系？3.切片的厚度一般为？4.最常用的是什么染色？是哪两种染料组成的？染色后结果是？5.怎样判断一张切片是否优秀？,祝：健康 快乐！,Thank you!,
