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1、生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,1.实验目的,掌握用差速离心技术分离制备动物细胞核及线粒体的方法。掌握细胞核及线粒体的活体鉴定方法。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,2.实验原理,1）分级差速离心 在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。悬浮介质通
2、常采用缓冲的蔗糖溶液。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,2.实验原理,2）染色原理詹纳斯绿可专一性地对对线粒体进行活染,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态),呈蓝绿色。Gimesa是一种复合染料，即为酸性染料与碱性染料的结合物。在水溶液中电离为带正电和负电的染料离子。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,3.实验材料、用品,实验材料：鼠肝脏,猪肝脏 实验用品：试剂：(1）0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4)(2)0.34mol/L蔗糖-0.01mol/LTris-盐酸缓冲液（p
3、H7.4）。(3)1%詹纳斯绿B(Janus green B)染液,称取50mg（pH7.4）,詹纳斯绿B溶于5ml生理盐水中,稍微加热使之溶解后,过滤,即为1%原液。(4)姬姆萨染液（Giemsa）。(5)1/15 mol/L磷酸缓冲液。（pH6.8）(6)卡诺（Cornay）固定液：无水乙醇6 ml冰醋酸1 ml氯仿3 ml(7)生理盐水。仪器及用具：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻度离心管，显微镜，牙签，冷冻高速离心机。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,4.实验步骤,4.1 制备肝细胞匀浆：实验前将鼠空腹12小时，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸
4、干水，称取肝组织1 g，剪碎；用预冷0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加9 ml预冷的0.25mol/L蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在04冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，肝匀浆用双层纱布过滤(滤液制一张涂片,自然干燥).,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,4.2 分离细胞核,鼠肝1克匀浆 匀浆过滤 滤液（制涂片一张）将滤液4.5mL覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖溶液上 700g离心10min 沉淀（细胞核及碎片）上清液1(制一张涂片,自然干燥)洗涤（0.25mol/L预冷蔗糖溶液5mL洗涤两次）每次1000g离心15min 沉淀（细胞核）上清液2(与上清液1
5、合并),鼠肝1克匀浆 匀浆过滤 滤液（制涂片一张）将滤液4.5mL覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖溶液上 700g离心10min 沉淀（细胞核及碎片）上清液1(制一张涂片,自然干燥)洗涤（0.25mol/L预冷蔗糖溶液5mL洗涤两次）每次1000g离心15min 沉淀（细胞核）上清液2(与上清液1合并),鼠肝1克匀浆 匀浆过滤 滤液（制涂片一张）将滤液4.5mL覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖溶液上 700g离心10min 沉淀（细胞核及碎片）上清液1(制一张涂片,自然干燥)洗涤（0.25mol/L预冷蔗糖溶液5mL洗涤两次）每次1000g离心15min 沉淀（细胞核）上清液2(与
6、上清液1合并),鼠肝1克匀浆 匀浆过滤 滤液（制涂片一张）将滤液4.5mL覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖溶液上 700g离心10min 沉淀（细胞核及碎片）上清液1(制一张涂片,自然干燥)洗涤（0.25mol/L预冷蔗糖溶液5mL洗涤两次）每次1000g离心15min 沉淀（细胞核）上清液2(与上清液1合并),生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,4.3 分离线粒体,混合上清液10000g离心10min 沉淀（线粒体）上清液（弃去）洗涤，加 0.25mol/L预蔗糖溶10mL,10000g离心10min,重复洗涤两次 沉淀（线粒体）上清液（制一张涂片后弃去）,涂片方法示意图,生物科
7、学与工程系细胞生物学实验教学研究室,4.4 分离物鉴定,细胞核：将干燥后的三张涂片加入Carnoy固定液15min，晾干。Giemsa染液染10min,蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水，用显微镜（40）检查。线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上，勿太密。滴加 1%詹纳斯绿溶液染色，10分钟后用光学显微镜观察。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,4.5 线粒体的超活染色与观察,口腔上皮细胞线粒体的超活染色：1/5000詹纳斯绿B1-2滴，口腔上皮细胞（牙签刮取），载玻片于37恒温染色10-15min，显微镜下观察。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,5.实验结果,细胞核呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色碎片。线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,口腔上皮细胞的线粒体分布,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,6.注意事项,分离全过程要在04进行，如果使用非冷冻控温的离心机一般只宜分离细胞核和线粒体，同时注意使样品保持冷冻；尽可能充分破碎组织，缩短匀浆时间。整个分离过程不宜过长。,生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室,7.思考题,要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？,
