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1、1、掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征2、学习细菌的革兰氏染色原理和方法3、了解细菌的特殊结构：芽孢和荚膜5、学习训练无菌操作技术。,实验目的,细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。,实验原理,1 细菌的简单染色,常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。,实验原理(continued),常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分
2、子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。,1、菌种,枯草芽孢杆菌培养物1d,2、染色剂,石碳酸复红染液,实验材料,菌悬液,滴加无菌水,取菌苔,操作步骤,涂片,固定,干燥,染色水洗,干燥镜检,1、涂片,取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环沾取）生理盐水（或无菌水）于玻片中央，用接种环以无菌操作从枯草杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-2环直接涂于载玻片上。Notes:1）载玻片要洁净无油迹 2）滴生理盐水和取菌不宜过多 3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。,操
3、作步骤（continued）,3、固定,固定的目的：1）使细胞质凝固，以固定细胞形态；2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。,固定方法：涂面朝上，通过火焰数次注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态,操作步骤（continued）,2、干燥 室温自然干燥,4、染色,将玻片平放于桌面上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。石碳酸复红染色约1min。,操作步骤（continued）,5、水洗,倒去染液，用洗瓶（或自来水）轻轻冲洗，直至涂片上流下来的水无色为止。Note:水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。,7、镜检
4、,一般使用油镜（100倍）观察细菌个体形态。要观察染色结果并绘图。,操作步骤（continued）,6、干燥,自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。,Notes:必须等涂片完全干后才可滴加香柏油,单染色法只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常用的有：革兰氏染色法、芽孢染色法、抗酸染色法等2、革兰氏染色,细菌细胞壁的结构,G细胞壁的网状结构致密，交联度高，用乙醇处理后，发生脱水作用，肽聚糖层孔径缩小，透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。G肽聚糖层较薄，交联度低，含较
5、多类脂质，故用乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞被脱色，经沙黄复染呈红色。,革兰氏染色的实验原理,结晶紫初染,碘液媒染,乙醇脱色,番红复染,涂片固定,革兰氏染色的步骤,1.涂片2.初染：滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4.脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约1520秒后，立即用流水冲洗。5.复染：滴加番红染色液，染35分钟，水洗后用吸水纸吸干。6.镜检：观察染色结果并绘图。,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、自己接种的斜面培养物,Figu
6、re 1-A Gram stain of Gram+Staphylococcus cells.,Figure 2-Gram stain of Gram E.coli cells,3 枯草杆菌芽孢的染色,枯草芽孢杆菌2（24h培养物）1、制备菌液：加4-6滴蒸馏水于小试管中，用接种环从斜面挑取菌体3-5环于试管中充分混匀。（7人一组）2、染色：加孔雀绿5滴于小试管中。3、加热：沸水浴，15-20分钟。4、涂片：用接种环从小试管中取一环菌涂于一干净载玻片上，制成涂片。5、干燥、火焰固定6、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。7、复染：加复红染色1-2分钟，水洗，吸水纸吸干。、镜检：10 x，40
7、x、100X（油镜）观察。绘图,4 细菌荚膜的染色,荚膜,负染色法：胶质芽胞杆菌1、制片：取洁净的载玻片一块，加一滴黑墨水，取少量的菌体放入墨水滴中混匀并涂片。（也可用刮片法：另取一载玻片，以三十度角将其边缘浸入黑素中向右端拖动，将黑素涂成一薄层。）2、镜检：10 x，40 x 物镜观察（注意物镜不要接触黑素，不要用油镜观察）,实验报告,1、细菌简单染色、革兰氏染色的原理、方法和步骤。2 记录所观察到的染色结果，并绘图2、思考题,本次实验课结束请确保油镜头擦拭干净！,擦油镜镜头方法：A）先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油 B）用擦镜纸沾少许乙醚酒精（二甲苯），擦拭镜头；C）再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的乙醚酒精。,
