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1、概念（补充1）,亚原生质体-原生质体融合：Subprotoplast-protoplast fusion 小原生质体：Miniprotoplast 微原生质体：Microprotoplast 胞质体：Cytoplast,原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplas
2、t)。胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。,微原生质体融合,植物微原生质体融合是在此基础上发展起来的将一种植物的一条或几条染色体转移到另一种植物中的新的非对称原生质体融合的方法。其原理是采用适当浓度的微核诱导剂，包含DNA合成抑制剂和纺锤体毒素两大类，常用的如秋水仙素(COL)、安磺灵(oryzalin)、草胺磷除草剂(eremart)、甲基氨草磷(ApM)、甲氨喋吟(MTx)、氯苯胺灵(CIPC)等。这些药剂可使正在分裂的植物细胞停留在有丝分裂中期，数小时后，染色体解开螺旋，形成内含多个微原生质体的微核化细胞，每个微原生质体内含有一条或几条染色体，由于有丝分
3、裂停留在中期，每条染色体的两个姐妹染色单体仍在一起，着丝点不分开。通过酶解去掉微核化细胞的细胞壁获得微核化原生质体，再用离心等技术分离出带有一条或几条染色体的微原生质体，诱导其与完整的受体原生质体融合，从而实现部分基因组的转移。微原生质体融合主要包括3个步骤:微原生质体诱导、分离以及富集、微原生质体融合和植株再生。,体细胞杂交：Somatic hybridization 细胞融合：Cell fusion 原生质体融合：Protoplast fusion 无性杂交：asexual hybridization 超性杂交：Parasexual hybridization 超性融合：Parasexua
4、l fusion 细胞操作：Cell manipulation 细胞工程（Cell engineering）,概念（补充2）,无性杂交(asexual hybridization):使两个亲本的原生质体融合成为一个具双亲遗传物质的杂种细胞，并在人工培养下使之形成杂种果树的杂交方法。无性杂交不受亲缘关系限制，特别是某些不能有性杂交的果树，可以采用无性杂交方法育种，培育新的果树类型。其选择杂交亲本的范围比有性杂交更广泛，遗传基础更复杂。超性杂交(Parasexual hybridization)：又称准性生殖，不经过减数裂就能导致基因重组的生殖过程称为准性生殖。细胞操作（或细胞工程）:利用细胞融合
5、和显微操作等方法对生物体的基本单位-细胞(包括体细胞和生殖细胞)直接用手操作,创造出对人类有价值的物质和生命体的技术。包括细胞融合技术、细胞器移植、染色体工程和组织培养技术。细胞操作、染色体操作以及基因操作的关系密切，有时统称细胞操作。,举例说明细胞融合和技术,三白草和鱼腥草原生质体融合1、材料 三白草科(Saururaceae)是古草本类中的一个稳定成分，对研究被子植物起源和早期演化具有重要意义。它是一个古老的残存小科，现仅存4属6种，其中有3属4种分布于东亚，2属2种分布于北美，呈典型的东亚一北美间断分布。在我国的主要分布情况是:三白草产河北、山东、河南和长江流域及以南各省区鱼腥草分布于甘
6、肃、陕西以南，东至台湾，西南至云南、西藏，湖南全省广布;,2、试剂及试液,2.1 CPW溶液2.2 混合酶液的组成2.3 融合液的组成2.4 原生质体培养基,CPW溶液,该溶液用于配制酶溶液，或分离原生质体以后纯化原生质体时作为清洗液用，其常用配方如下:,为保持分离原生质体过程中的高掺状态，在上述溶液中加入了甘露醇或蔗糖:CPW9M溶液是含有9%甘露醇的CPW溶液;CPW13M溶液是含有13%甘露醇的CPW溶液;CPW21S溶液是含有21%蔗糖的CPW溶液。,混合酶液的组成,混合酶液主要有纤维素酶、果胶酶、甘露醇、CaCI2H20(mg/L)、MES，KH2PO4;H20组成，前三者各选用了三
7、个不同浓度。,2-吗啉乙磺酸生物缓冲液,所用酶液均经0.40m网过滤消毒,融合液的组成,原生质体培养基,3、仪器设备及试剂,方法,关于振荡培养,非对称体细胞融合获得花椰菜（Brassica oleracea L.var.botrytis）与Brassica spinescens的种间杂种,受体基因型的筛选,以花椰菜、结球甘蓝等甘蓝品种（Brassica oleracea L.）为材料，通过下胚轴原生质体培养筛选合适的基因型作为原生质体非对称融合的受体材料。,供受体原生质体制备,供体Brassica spinescens叶肉原生质体来自培养在光照条件下的无菌苗伸展幼叶，受体花椰菜原生质体来自在黑
8、暗条件下萌发56d的无菌苗下胚轴。供、受体材料原生质体游离、纯化和溶液配制参照Ryschka的方法进行，步骤如下：,原生质体融合方法,原生质体融合采用PEG融合法，按Ryschka的方法进行，略作修改，步骤如下：按1:1的比例混合供体、受体的原生质体，混合均匀。在直径为5cm的无菌塑料培养皿中滴加7滴混合原生质体溶液，每滴40l，静止放置10min使原生质体沉积在培养皿底部。然后在每滴两侧加60l 40的PEG溶液。5min后，稍微倾斜培养皿去掉培养皿中的混合液。随后，小心加入13的PEG溶液2mL，5min后去掉。再小心加入6.7的PEG溶液2mL,5min后去掉。用1/2培养基洗涤培养皿两
9、次，最后，加入1/2培养基2mL用于原生质体培养。,原生质体培养,融合细胞发生第一次分裂后加入400l 2/2培养基，置于弱光照下培养，以后每隔3d加400l 2/2培养基，直到小细胞团形成。将小细胞团转入1/3固体培养基，在弱光照下培养5d后，抽掉固体培养基表面的浮液，进行常温正常光照培养。愈伤组织约5mm大小转入4/1培养基进行不定芽诱导。2030d后，将不定芽转入MS基本培养基附加0.02mgL-1-萘乙酸（NAA）促进植株生根。,杂种鉴定,再生植株形态学鉴定 当再生植株长到3-4片真叶时开始进行形态鉴定。仔细观察植株的叶片形态，叶片颜色和植株形态，通过与供受体植株形态进行比较，从形态上
10、鉴定杂种植株。再生植株同工酶鉴定 利用聚丙烯酰胺等电聚焦电泳技术，参照郑晓鹰的方法进行过氧化物酶(POX)酶谱分析。实验步骤如下：,RAPD分子标记鉴定杂种植株,植株总DNA的提取,再生植株RAPD检测,以总DNA为扩增模板，进行常规RAPD扩增和电泳。从人工合成的46条随机引物筛选出1条两亲本谱带差异明显的随机引物（5ACCAGGTTGG 3）鉴定杂种核基因组。PCR反应程序：94预变性3min；94l变性60s、37退火60s、72延伸90s、共5个循环；94变性60s、40退火60s、72延伸90s、共35个循环，最后72延伸10min。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。,遗传
11、图谱构建的问题RAPD是一种显性标记，符合孟德尔遗传定律，不能区分杂合型和纯合型，因此在遗传分析及遗传图谱的构建等一些方面受到限制。目前，在实践中，主要利用了以下2种方法。利用单倍体 利用胚乳进行RAPD分析，可以克服构建遗传图谱中这些困难。因为针叶树的胚乳是单倍体，记录了杂合的母本染色体组在减数分裂过程中的遗传事件，不存在杂合型，进行RAPD遗传分析时，与共显性标记具有同样的遗传行为，是天然的优良作图材料。现在已进行遗传图谱构建的有湿地松、欧洲赤松、火炬松、杨树、日本柳杉和桉树。但是由于缺乏细胞遗传学的研究，暂时还不能确定连锁群和染色体之间的对应关系。,将RAPD条带作为单剂量标记，单剂量标
12、记(Single-dose RAPD markers)是从两物种和其杂交产生F1代的分子标记中选择的。选择构建图谱用的标记有2个原则：A、它们必须在一个亲本中存在而在另一个亲本中不存在；B、它们在后代中必须以l：1分离。这种方法相当于一个杂合体和一个隐性纯合体的测交，称为双向假测交(Two-way pseudo-testcross)。在多倍体植物中，不论基因组是如何组成的(异源多倍体或同源多倍体)，也不论材料的多倍性水平如何，单剂量的标记都相当于简单的等位基因(同源多倍体)或相当于二倍体基因座上的杂合等位基因(异源多倍体)。因此根据这些单剂量标记的连锁情况可以构建分子图谱。RAPD条带作为单剂
13、量标记使那些基因组DNA含最大，世代周期长的乔木和多倍体植物的遗传图谱研究走出了几乎停滞的状态。Grattapagalia利用这种策略首先构建了巨桉和尾叶桉的分子连锁图谱。Conner利用这种策略构建了3个苹果品种的分子图谱。Mudge利用甘蔗及杂交后代的RAPD条带作为单剂量标记进行连锁分析构建了甜根子草的51个连锁群，并分析了其染色体组的数目。虽然这些连锁图谱是个体特异性的，但可以为数量性状定位提供框架结构，为标记辅助选择育种奠定基础。,RAPD，即随机扩增多态性DNA技术，是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PCR。它的应用是基于这样的一个推理
14、：对于同一模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。,流式细胞仪鉴定杂种植株倍性,取叶片2.0g放入加有1mL细胞裂解液（见附录4）的培养皿中，用锋利的刀片切碎，再加1mL细胞裂解液，用300目的尼龙网将过滤液过滤至样品管中，800rpm离心5min，倒掉上清液，加入300lPI染液（见附录4），然后将样品管放入冰盒，避光反应30min后上机检测（FACSCalibur，BD CO.LTD）,图中第一个峰(G1)是DNA含量为2N 的细胞峰,第二个峰是DNA含量为4N 的细胞峰,两峰之间是DNA含量为2N-4N的处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞。,谢谢！,
