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1、教学参考书,实用流式细胞术彩色图谱。王树奎、周振英主编。2004.4临床流式细胞分析。王建中主编。上海科学技术出版社。2005.8流式细胞术原理与应用教程。吴后男编。北京大学医学出版社。2008.2实用流式细胞术-血液病篇。刘艳荣主编。北京大学医学出版社。2010.9流式细胞术。陈朱波、曹雪涛编。科学出版社。2010.10,主要内容,一、流式细胞仪结构和原理流式细胞术简介流式细胞仪的结构组成流式细胞仪的光信号检测流式细胞术数据的存贮、显示与分析流式分选二、流式细胞术操作与技巧三、流式细胞术在生物医学中的应用,1.1 流式细胞术简介,流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞
2、仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。流式细胞仪（Flow Cytometer）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。,流式细胞术的特点,检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；检测参数：多参数；检测特点：单细胞水平分析；检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒；检测结果：精度高、准确性好；可对目标细胞进行分选；,流式：单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准；WB：群体分析，得到多个细胞的平均值。,流式细胞仪的发展及商品化,1934 Moldavanl:F
3、irst try(固定式细胞分析-流动式)；1953 Crosland-Taylor:鞘流系统(解决难题)；1956 Coulter原理(血细胞计数器)；1965 Kamentsky:分光光度计定量细胞成分和散射光应用；1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置；1969 Vandilla等:第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)；1972 斯坦福大学:研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)；1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流 式细胞仪-FACS。1975 Kohler和Milstein:单克隆抗体技术(促进流式发展)。,1979年 国家科委重点项目：研制国内第一台
4、激光流式细胞仪；1982年 国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生；1984年 国家科委组织科研成果的鉴定验收；1985年 获国家卫生部科技成果乙等奖；1985年-1990年 灵敏度、信噪比、更多参数；流式分选仪研制开发；计算机四参数软件；样品制备、医学生物学应用。,流式细胞仪的分类,分析型流式细胞仪细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。分选型流式细胞仪既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选。,BD公司分析型流式细胞仪,FACS Calibur 双激光四色，市场覆盖率最高,LSR II 双激光六色，三激光八色，四激光十
5、色，分析型最高配,FACS Canto II 双激光六色，三激光八色,FACS Verse双激光六色，三激光八色,BD公司分选型流式细胞仪,FACSVantage SE,FACSAria III,Influx,Beckman Coulter流式细胞仪,Epics XL 单激光四色，市场覆盖率高，分析型,CyAn三激光九色，分析型,FC 500 单激光或双激光五色，市场覆盖率高，分析型,Gallios 三激光十色，分析型,MoFlo XDP 高端分选型,1.2 流式细胞仪的结构组成,液流系统流动室液流驱动系统光学系统激发光源光束收集系统电子系统光电转换器数据处理系统细胞分选系统喷嘴电偏转板样本收
6、集器,1.2.1 液流系统,鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液(sheath)。流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在10-20um，避免了多个细胞重叠进入检测区。,鞘液,鞘液,细胞流,激光照射点,流体动力学聚焦示意图,（一）流动室和液流驱动系统,流动室(flow cell,flow chamber)是流式细胞仪的核心部件。流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。,流动室结构图：单细胞发生器,液流驱动系统,（二）进样速率控制,通过改变样本压力可以调
7、节样本的进样速率，而这并不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加，这样会导致变异系数增加。,1.2.2 光学系统,（一）激发光源：激光器气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子(647nm)、氪氩(568nm)；染料激光器：如氩离子激光泵浦的Rhodomin 6G水溶液染料激 光器，发出550-650nm可变波长激发光；半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长。BD的FACS Calibur 已采用635nm半导体激光器。激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。现在仪器常配有仪器选配2-4根
8、激光器，波长多为488nm、633nm和355nm、405nmUV；,（二）光束成行系统,FCM的单细胞照明技术：这种椭圆形光斑的检测区保证样本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。,细胞流动方向,（三）光收集系统,滤光片的组成长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过；短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过；带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。,FACSCalibur流式细胞仪信号检测系统,透射光路,全反射光路,FACS Aria流式细胞仪器信号检测系统,PE-Cy7,PerCP-Cy5.5,PE-TexasRed,PE,FITC,SSC,1.2.3 电子系统,光电检
9、测器将光信号转换成电子信号。前置放大电路将信号等比例放大，输出电脉冲信号。模数转换器将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。数据处理系统计算机系统数据采集、分析。,（一）光电检测器(photodetector),光电二极管(photodiode)光灵敏度低，测定强信号（FSC）；光电倍增管(photomultiplier,PMT)光灵敏度高，测定弱信号（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。,（二）电信号两种放大方式,由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。线性(linear;lin)对数(logarithmic;log)一般FSC和SS
10、C变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。,（三）电脉冲信号的面积A、高度H和宽度W,Creation of a Voltage Pulse,Quantification of a Voltage Pulse,Width=Area/Height,通道(channel)一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管/倍增管，就有多少个通道：散射光通道:FSC通道和SSC通道；荧光通道通道命名方式：以FL(fluorescence)加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。For example：FAC
11、SCalibur有488nm和633nm两根激光器，488nm能检测FSC、SSC、FL1(FITC)、FL2(PE)、FL3(PerCP)，635能检测FL4(APC)，代表Calibur有6个通道，最多能同时检测4个荧光，6种参数。,1.3 流式细胞术光信号检测,光信号的类型散射光信号：与标记荧光素无关，是细胞的固有参数。前向散射光(forward scatter,FSC);侧向散射光(side scatter,SSC).荧光信号自发荧光：微弱特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。,1.3.1 散射光信号,（一）前向散射光FSC FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般
12、在1-6度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小和活力。,（二）侧向散射光SSC,SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。,（三）散射光的作用,实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。,粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,红细胞、死细胞和碎片,死细胞或碎片,粘连细胞,肿瘤细胞株FSC/SSC散点图,死细胞,加药处理后FSC/SSC散点图,通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。,（三）阈值 Threshold,阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生
13、微小的干扰信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。,5%,32%,默认阈值,升高阈值后,1.3.2 荧光信号,（一）荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。,发射波长(荧光波长)Emission wavelength,激发波长Excitation wavelength,（二）常用荧光素,499nm 蓝色荧光（Blue）；500-549nm，绿色荧光（Green）；550-584nm，黄色荧光（Yellow）；585-615nm，橙色荧光（Orange）；616-700n
14、m，红色荧光（Red）；700nm，远红外荧光（Far-Red）。标记抗体的荧光素,核酸荧光染料PI（碘化丙啶 535,623）可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。7-AAD（7-氨基放线菌素D 545,647）以插入的方式与DNA链的G-C碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358,456）可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定量染料。Hoechst（343,450）常见
15、为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。PY（派若宁 560,573）RNA染料，能进入活细胞。AO（吖啶橙 509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。,其他常用荧光染料,（三）荧光抗体的选择,A 根据流式细胞仪选择抗体流式细胞仪能检测的通道数(由激光器种类、数量和使用的光学滤片决定)。如FACSCalibur：多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意
16、搭配。FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。,B 根据抗原表达强弱合理选择抗体不同的荧光素强度有所不同；高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原：CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE,C 选择荧光波谱间光谱重叠较小的荧光染料进行组合，同时需要正确的调节补偿。,CD5,1.4 FCM数据存储、显示与分析,标准的FCM数据采用列表模式（list mode），记录了每个细胞的所有参数的信息。每个细胞检测5个参数，那么获取10000个细胞，容量为510000（字或双字）。,FCM数据显示方式,单参数直方图(Histogram
17、)双参数数据显示：散点图(Dot Plot)伪彩图(Pseudo-color Plot)等高线图(Contour Plot)密度图(Density Plot)假三维图(Pseudo 3D Plot)三维图(3D Plot),常用分析软件CellQuestDivaFlowJOWinMDIFCS Express,直方图Histogram,细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数。,Counts,FITC荧光强度,横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。,DNA倍体分析,抗原表达分析,Overlay图,散点图,散点图中每个点代表一个细
18、胞，X轴与Y轴分别代表一种参数，优点是比直方图直观。,散点图和伪彩图,等高图和密度图,等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。,假三维图和三维图,设门与数据分析,门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。,椭圆形,圆形,矩形,任意形状,R(Region，区域)。门可以是单一区域(G=R1)，也可以是几个区域组合在一起：G=R1 and R2;G=R1 or R2;G=R1 not R2。,十字门,线性门,1.5 流式分选,电荷式分选超
19、声振动器(15-100kHz)液流充电系统高压偏转板收集装置(流式管、培养板),lasers,断裂点(充电),高压偏转板,四路分选原理,电荷式分选装置,液滴延迟,在含有分选细胞的液滴上准确加电是有效分选的关键，但是细胞经过检测区(激光照射点)到加电位置(断裂点)有一个时间差，这称为液滴延迟(drop delay)。延迟时间直接影响着分选纯度，准确测定延迟时间是一个重要步骤。,液滴延迟,照射点,分选指标,分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、需要收集的细胞数。,分选时间表(机器流速10000个/s时),分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比，
20、一般能达99%以上。分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率降低，反之亦然。富集模式(enrich mode)纯化模式(purify mode)单细胞模式(single cell mode),流式分选和磁珠分选,FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting)流式分选MACS(Magnetic-Activated Cell Sorting)磁珠分选,磁性标记,未标记的细胞先行流出,洗脱阳性细胞,阳性分选策略,流式分选与磁珠分选比较,流式分选结合磁珠分选的方法，常应用于分选低比例细胞群。如分选调节性T细
21、胞CD4CD25 CD127low，先用磁珠分选纯化CD4 T细胞，再用流式分选的方法分选CD4CD25 CD127low调节性T细胞。,二、流式细胞术操作与技巧,流式细胞术操作流程：,2.1 单细胞悬液制备2.2 免疫荧光标记2.3 对照的设置2.4 光谱重叠与补偿,2.1 单细胞悬液制备,2.1.1 新鲜实体组织的样本制备 对于不同组织来源的实体组织和实体瘤标本，应该根据各自特点选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产量高、损伤小的目的。常用方法有：酶消化法机械法化学试剂处理法,酶消化法：根据分散组织类型来确定使用的酶类：胰蛋白酶水解酯键、肽键；胶原酶降解几种分子类型的胶原；溶菌酶水解糖蛋
22、白、肽的糖苷键；弹性蛋白酶消化糖蛋白、弹性蛋白的纤维。将新鲜组织置于离心管中，加入1-2ml酶消化20-30min（恒温37或室温），间断振荡或吹打；终止消化，收集细胞悬液，300目尼龙网过滤，除去细胞团块，低速离心除去细胞碎片；将制备好的单细胞悬液进行荧光标记或保存备用。注意：酶的使用浓度、温度、消化时间、酶活性的pH值。,机械法特点：易造成细胞碎片和团块，实际操作时，应注意碎片和团块的去除，常与其他方法（如酶消化法）配合使用。,组织解离器,机械法：有剪碎法、网搓法、研磨法等。利用机械方法、物理方法给予组织交大的压力，使细胞从组织间分散开来。,化学处理法：作用原理：将组织细胞间起黏着作用的钙
23、、镁离子置换出来，从而使细胞分散开来，常用试剂有EDTA、EGTA、TPB等。EDTA是一种螯合剂，可以和组织间的钙、镁离子形成螯合物，实际运用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白酶）。特点：用化学法细胞存活率低、细胞产额低，细胞碎片和聚集量不稳定。,机械法往往造成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量，注意去除细胞碎片和团块以免影响FCM结果，如低速离心去碎片、尼龙网过滤团块等。酶消化法、化学试剂处理法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成分的不良影响。根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，最终要求细胞呈单个分散状态；细胞碎片、团块尽量少；细胞活性不受到明显损伤，保证下一步荧光
24、染色。,2.1.2 石蜡包埋组织样本制备,切片：将石蜡组织切成50um厚的组织片4-5片，放入1试管中；脱脂：加入二甲苯3-5ml脱脂，室温下1-2天，脱净后弃二甲苯；水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步10 min，去乙醇后加入蒸馏水3-5ml，3-5min后弃水；消化：加入5ml 0.5%胃蛋白酶（pH 1.5-2.0），37恒温水浴30 min，每隔5-10min振荡一次；终止消化：加冷的PBS或生理盐水终止消化；过滤：用300目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第二次消化；收集细胞悬液：将过滤液离心沉淀，再用PBS漂洗1-2次，低速离心沉淀去除碎片；根据实验目
25、的标记荧光抗体，或保存细胞备用。,2.1.3 血液、骨髓样本制备,外周血单个核细胞PBMC的分离,注意：由于多核粒细胞比较大，粒细胞沉降在红细胞层，所以该法不适合粒细胞研究；该法操作过程中可能丢失一些有意义的细胞或细胞亚群，所以临床上一般不主张分离血液或骨髓的单个核细胞。,红细胞裂解液去除红细胞原理：红细胞裂解液成分为低渗的NH4Cl溶液，利用双凹型的红细胞膜抗性差，白细胞膜抗性比较好的特点，加入低渗透压的红细胞裂解液时，红细胞膜胀破，而白细胞膜不受影响，从而达到去除红细胞的目的。,溶血/免洗(lyse/no wash)技术临床上应用溶血/免洗技术，既简化了操作步骤，又避免了洗涤过程中可能造成
26、的某些亚群细胞的丢失。尤其在检测严重污染性标本时，避免了因离心等处理可能导致气溶胶产生引起病毒感染的可能。,2.1.4 培养细胞单细胞悬液制备,2.1.5 体液脱落细胞样本制备,悬浮生长细胞,吸管反复吹打,贴壁生长细胞,消化处理,离心获得单细胞悬液,洗脱液尿液胸腹水,离心收集细胞，用生理盐水或PBS洗涤3次,300目尼龙膜过滤后离心沉淀去上清,单细胞悬液,FCM可检测下列细胞成分：表面标记物胞浆标记物核内标记物可溶性成分,2.2 免疫荧光染色,荧光素偶联抗体抗体上偶联荧光素(FITC、PE等)，通过抗原抗体反应让目标细胞特异性的带上荧光。染色过程即抗原抗体反应过程。荧光染料/荧光化合物PI、D
27、API等插入核酸链中；CFSE和蛋白质共价结合；Annexin V-FITC检测凋亡。荧光蛋白如GFP，不需要染色，直接检测。,免疫荧光染色主要包括直接和间接免疫荧光染色两种方法。间接标记的方法难以进行多色标记，而且操作复杂、信噪比高，所以一般首先直标荧光抗体。,荧光抗体,荧光二抗,第一抗体,直接标记,间接标记,一般检测时，获取12万个细胞，标记0.51106细胞即可。下述情况细胞量需相应增加：检测胞内/核内抗原，离心次数多；细胞周期乙醇固定损失细胞多；检测细胞在标本中比例低,0.51106个细胞,孵育体积50-100ul,上机体积200-500ul终浓度约1106个/ml,加染料,洗涤后补加
28、液体,细胞表面抗原标记,表面抗原分析是流式应用中最广泛的，标记步骤也相对简单。标记：取0.51106细胞，加入适量抗体(根据抗体说明书)，充分混匀后(总体积50-100ul)，4 避光孵育10-30min。洗涤：加入1ml PBS洗液，300g离心洗涤5min。上机检测：弃去上清后加入200-500ul PBS，重悬细胞后立即上机检测；如不能及时上机检测，则加入同样体积的1%多聚甲醛，混匀后置于4 冰箱内保存，一般不超过24h。,胞内抗原荧光标记,细胞内抗原：如MPO；核内抗原：如FoxP3；细胞内细胞因子(胞内因子)：IFN-r、IL-4、IL-17等。固定：4多聚甲醛破膜/透化0.05%皂
29、素(saponin)；0.01%Triton X-100 70%乙醇,膜表面抗原染色：分别加入相应的荧光素标记抗体和适量细胞标本，充分混匀后避光孵育10-30min。洗涤：加1ml PBS洗液，300g离心5min。固定：去上清后加入500ul 4%多聚甲醛，固定20min。透化：离心洗去固定剂后，加皂素500 ul，透化10min。胞内抗原染色：离心洗去透化液后，加入相应荧光素标记抗体，混匀后室温避光孵育30 min。洗涤：加1ml PBS洗液，300g离心5min。上机检测：弃去上清后加入PBS 200-500 ul后上机检测。,2.3 对照的设置,空白对照细胞内物质自身也发出荧光，能被F
30、CM灵敏的检测到，这种未染色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性的结果。,流式结果中荧光强弱是一个相对值，光电倍增管电压越大，电子信号越强；电压越小，信号越弱。通过调节电压，使阴性对照管的荧光强度处于阴性的位置，实验组的荧光值都是相对对照组。,同型对照 Isotype Control,非特异性染色抗体的Fc段可以与细胞表面的Fc受体非特异性结合；抗体进入胞内，不容易洗脱，造成非特异性染色。同型对照是指使用与实验抗体相同种属来源、相同剂量及同种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照，用于消除抗体非特异性结合到细胞上而产生的
31、背景荧光。实验抗体：FITC-CD3单克隆抗体为鼠IgG1亚型抗体;同型对照：未免疫小鼠血清纯化的IgG1，并标记FITC，相同剂量。,阳性对照Positive Control,设置阳性对照是为了检测荧光抗体是否有效，并不是每次分析时都必须设置：使用新的荧光素抗体时；使用存储时间较长的荧光素抗体时。设置阳性对照的方法：用肯定表达有该抗原的细胞来检测；已经证明有效的、偶联其他荧光素的该抗原的抗体。,单标对照Single Staining Control,用于补偿的调节。,2.4 光谱重叠与补偿,当细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长荧光时，理论上可选择滤光片使每种荧光仅被相应的通道检测到。但由于
32、目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射的峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠，因而少量的荧光信号会被另一通道检测到，这种现象就是光谱重叠(spectral overlap)。,FL1 530/30,FL2 585/42,发射波长,FITC发射谱,PE发射谱,实验操作中，常利用电子技术和计算机软件设置的方法将串入相邻荧光通道的信号扣除，这种技术称为荧光补偿(fluorescence compensation)。,FL2-%FL1,FL-1(FITC),FL-2(-),FL1-%FL2,通过单标调节补偿,补偿前,补偿后,未补偿,正确补偿,FITC-PE补偿太大,PE-FITC补偿太大,补偿调节要合适,
