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1、1960s LelandHartwell，1970s Paul Nurse 以芽殖酵母和裂殖酵母为实验材料，利用温度敏感突变株，发现许多与细胞分裂有关的基因（cell division cycle gene，cdc）。如：裂殖酵母 cdc2、芽殖酵母 cdc28 突变型在限制温度下无法分裂；Wee1 突变型提早分裂，cdc25 突变型细胞体积增大而不分裂；cdc2 和 cdc28 都编码一个 34 KD 的蛋白激酶（p34cdc2，p34cdc28），且属于同源物，均能促进细胞周期的进行，在调节 G1/S 转化中起作用。但这两种激酶只有结合相关蛋白后，才表现激酶活性。wee1 和 cdc25
2、分别表现为抑制和促进 CDC2 的活性。,Fission yeast,裂殖酵母细胞周期,budding yeast,芽殖酵母细胞周期,Cdc 25&Wee1 mutant,Cdc25 表达不足，细胞长得过长而不分裂；Wee1 表达不足，细胞很小就开始分裂了。,1980s Timothy Hunt发现海胆的卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期振荡，命名为周期蛋白(cyclin A 和B)。后来发现各类动物来源的细胞周期蛋白 mRNA 均能诱导蛙卵的成熟。1988年Lohka将非洲爪蟾的MPF纯化。经鉴定 MPF 由32KD 和 45KD 两种蛋白组成，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。进一步的研究发现M
3、PF=CDC2+clyclin B,MPF=CDC2+Cyclin B,Leland H.Hartwell,R.Timothy(Tim)Hunt,Sir Paul M.Nurse,2001年10月8日美国人LelandHartwell、英国人Paul Nurse、TimothyHunt因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖。,二、CDK,CDC2 与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性，故名细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)。CDC2又被称为CDK1，可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行，又称作细胞周期引擎。如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、
4、核膜消失；将 H1 磷酸化导致染色体的凝缩等。在动物中已知 7 种 CDK。均含有一段相似的激酶结构域，这一区域有一段保守序列，即 PSTAIRE，与周期蛋白的结合有关。,CKI 对细胞周期起负调控作用，阻止 Cyclin-Cdk 复合物的装配或活性；而将细胞阻止在不同的检验点。如DNA受损后，细胞将停留于G1 Checkpoint 让 DNA 修复或者凋亡。CDI 包括 INK4 家族和 CIP/KIP 家族：-Ink4（Inhibitor of cdk 4）：P16ink4a,P15ink4b，P18ink4c，P19ink4d。特异性抑制 cdk4cyclin D1，cdk6cyclin
5、 D1。-Kip（Kinase inhibition protein）：P21cip1(cyclin inhibition protein 1）P27kip1、P57kip2，抑制大多数 CDK 的激酶活性。P21cip1 还能与 DNA 聚合酶的辅助因子 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)结合，直接抑制 DNA 的合成。,三、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDKinhibitor，CKI）,P21cip1抑制CDK和PCNA,Two such checkpoints:1.One in late G1:provents entry into S
6、phase;2.One in late G2:provents entry into mitosis;P53:gene regulatory protein.DNA damage activates p53 by an indirect mechanism.P21(CKI protein)binds to G1/S-Cdk and S-Cdk and inhibits their activities,thereby helping to block entry into S phase.Mdm2 acts as a ubiquitin ligase that targets p53 for
7、destruction by proteasomes.Phosphrylated p53 reduce its binding to Mdm2.,DNA damage checkpoint:Cell-cycle progression is blocked by DNA damage and p53,四、细胞周期蛋白（cyclin）,特点：在细胞周期中呈周期性变化。含有一段约 100 个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与 CDK 结合。作用：激活CDK，决定 CDK 何时、何处、将何种底物磷酸化，从而推动细胞周期的前进。已知30余种，在脊椎动物中为A1-2、B1-3、C、D1-3
8、、E1-2、F、G、H等。分为4类：G1型、G1/S型、S型、M型。,G1期：在生长因子的刺激下，cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如 Rb 磷酸化，Rb 释放出转录因子 E2F，促进许多基因的转录，如编码 cyclin E、A 和 CDK1 的基因。G1-S期：cyclin E 与 CDK2 结合，促进细胞进入 S 期。Cyclin E 的抗体能使细胞停滞于 G1 期。在G2-M期：cyclin A、cyclin B 与 CDK1 结合，CDK1 使底物蛋白磷酸化、如将组蛋白 H1 磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体。,五、Cyclin-Cdk 复
9、合物的多样性及细胞周期调控,不同类型的CDK/cyclin复合体,*包括D1-3，各亚型 cyclin D 在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效。,cell cycle regulation,M 期 CDK 的激活起始于分裂期 cyclin 的积累。其浓度决定于降解的速度；但在大多数细胞的有丝分裂周期中，cyclin 的积累是因为在G2-M 期 cyclin基因转录的增强。结合 cyclin B 的 CDK1 被Wee1 将 Thr14 和Tyr15 磷酸化而不具有活性，使 CDK/cyclin不断积累。在 M 期，Wee1的活性下降，CDC 25 使 CDK 去磷酸化，去除了 CDK
10、活化的障碍。CDK 的激活需要 Thr161 的磷酸化，它是在 CDK 激酶（CDK activating kinase，CAK）的作用下完成的。,M期 CDK 的激活,CDK activating,1、Wee/Mik-14、15-磷酸化2、Cdc25c-14、15-去磷酸化3、CAK-16 磷酸化,The activation of M-phase cyclin-Cdk complexes(M-Cdks)triggers entry into mitosis,The activation of M-Cdk,在中期当 MPF 活性达到最高时，激活后期促进因子 APC（anaphase prom
11、oting complex），将泛素连接在 cyclinB 上，cyclinB 被蛋白酶体（proteasome）降解，完成一个细胞周期。分裂期周期蛋白 N 端有一段序列与其降解有关，称降解盒(destruction box)。当 MPF 活性达到最高时，通过泛素连接酶催化泛素与 cyclin 结合，cyclin 随之被 26S 蛋白酶体水解。G1 周期蛋白也通过类似的途径降解，但其 N 端没有降解盒，C 端有一段 PEST 序列与其降解有关。泛素由76个氨基酸组成，高度保守。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。26S 蛋白酶体是一个大
12、型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。,M期 周期蛋白与M/后期转化,Cyclin B的降解途径,在蛋白质的泛素化过程中，E1（ubiquitin-activating enzyme，泛素激活酶）水解ATP获取能量，通过其活性位置的半胱氨酸残基与泛素的羧基末端形成高能硫酯键而激活泛素，然后 E1 将泛素交给 E2（ubiquitin-conjugating enzyme，泛素结合酶），最后在 E3（ubiquitin-ligase，泛素连接酶）的作用下将泛素转移到靶蛋白上。参与细胞周期调控的泛素连接酶至少有两类：-其中SCF（skp1-cullin-F-box protein，三个蛋白构成
13、的复合体）负责将泛素连接到 G1/S 期周期蛋白和某些 CKI 上；-APC 负责将泛素连接到 M 期周期蛋白上。,Destruction Box in Cyclins,泛素激活酶,泛素结合酶,泛素连接酶,The cell-cycle control system depends on cyclical proteolysis-The control of proteolysis by SCF and APC during the cell cycle.,(A)The phosphorylation of a target protein(CKI),allows the CKI to be r
14、ecognized by SCF(constitutive active),E1and E2(two additional proteins),SCF serves as a ubiquitin ligase.The ubiquitylated CKI is then immediately recognized and degraded in a proteasome.SCF mediate the destruction of G1-cyclins,Cdk inhibitor,and other cell cycle proteins.(B)M-cyclin ubiquitylation
15、is performed by APC.,In G1 and S phase,In metaphase/anaphase,M-cyclins,Mitotic Cyclin-Cdk（MPF）复合物的活化与功能,活化-随 Cyclin 浓度变化而变化-激酶与磷酸酶的调节，活化的 MPF 可使更多的 MPF 活化。功能：启动细胞从 G2 期进入 M 期的相关事件,MPF随 Cyclin 浓度变化而变化,活化的MPF可使更多的 MPF 活化,激酶与磷酸酶的调节,MPF功能,Mitotic Cyclin-Cdk 复合物激活 Anaphase Pormotin Complex(APC)，调控纺锤体装 配检
16、验点-APC介导选择性降解的靶蛋白与 Ubiquitin 结合（通过泛素依赖性途径 降解）。-APC主要介导两类蛋白降解:Anaphase Inhibitors 和 Mitotic Cyclin。前 者维持姐妹染色单体粘连，抑制后期启动；后者的降解意味着有丝分 裂即将结束，即染色体开始去凝集，核膜重建。-Mad2蛋白位于动粒上，在染色体结合有丝分裂纺锤体前将不断从动粒 上释放而抑制APC的活性。所以只有所有染色体都与纺锤体结合后，APC才有活性，才启动细胞向后期转换。,The spindle-attachment checkpoint:Unattached chromosomes block
17、sister-chromatid separation The sister chromatid separation is triggered by proteolysis,The triggering of sister-chromatid separation by the APC.APC:anaphase-promoting complexThe destruction of Securin allows separase to cleave the cohesin complex.Securin(后期抑制因子)separasecohesin,泛素依赖性途径降解,细胞周期调控模型总结,
18、The summary of cell-cycle control system,六、细胞周期检验点（check point）,细胞要分裂，必须正确复制 DNA 和达到一定的体积，在获得足够 物质支持分裂以前，细胞不可能进行分裂。细胞周期的运行，是在 一系列称为检验点的严格检控下进行的，当 DNA 发生损伤，复制 不完全或纺锤体形成不正常，周期将被阻断。细胞周期检验点是细胞周期调控的一种机制，主要是确保周期每一 时相事件的有序、全部完成并与外界环境因素相联系。细胞周期检验点由感受异常事件的感受器、信号传导通路和效应器 构成。,检验点主要包括：-G1/S 检验点：控制细胞由静止状态的 G1 进入
19、 DNA 合成期，相关 的事件包括：DNA 是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是 否足够大？在酵母中称 start 点，在哺乳动物中称 R 点（restriction point）。-S 期检验点：DNA 复制是否完成？-G2/M 检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？-中-后期检验点：纺锤体组装检验点，任何一个着丝点没有正确连 接到纺锤体上，都会抑制 APC 的活性，引起细胞周期中断。,Four checkpoints,细胞周期检验点及其作用,G1 Cyclin-Cdk复合物对 Rb 蛋白磷酸化而调控 G1 检验点,The mechani
20、sms cotrolling S-phase initiation in animal cells.,The Rb protein acts as a brake in mammalian G1 cellsThe control of G1 progression and S-phase initiation is often disrupted in cancer cells,leading to unrestrained cell-cycle entry and cell proliferation.,ATM（ataxia telangiectasia-mutated gene）：是与DN
21、A损伤检验有关的一个重要基因。最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有1%的人是ATM缺失的杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。ATM编码一个蛋白激酶，结合在损伤的DNA上，能将某些蛋白磷酸化，中断细胞周期。其信号通路有两条：激活Chk1（checkpoint kinase）,使CDC25的Ser216磷酸化失去活性，抑制M-CDK的活性，中断细胞周期。激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作为转录因子，导致P21的表达，P21抑制G1-S期CDK的活性，中断细胞周期。,七、生长因子对细胞增殖的影响,单细胞生物的增殖取决于营养，多细胞生物细胞的增值取决于机体是否需要。这种需要是通过细胞通信来实现的。生长因子：是与细胞增殖有关的信号物质，已知几十种，多数能促进细胞增殖，又称有丝分裂原（mitogen），如表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF）。生长因子不是由特定腺体产生，主要通过旁分泌作用于邻近细胞。各种生长因子分子量大小不同。信号通路：ras 途径，cAMP 途径、磷脂酰肌醇途径。如通过 ras 途径，激活 MAPK，MAPK 进入细胞核内，激活 c-myc，myc 作为转录因子促进 cyclin D、SCF、E2F 等 G1-S 有关的基因表达，细胞进入 G1 期。,The End！,
