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1、2.2、土壤中分解尿素细菌分离与计数,两个主要目的：（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。,美国黄石国家公园的一个热泉,一、筛选菌株,（一）自然界中目的菌株筛选实例：PCR的自动化需要耐高温的 DNA聚合酶，这种酶要能忍受93左右的高温。,启示：,根据它对生存条件的要求，到相应的环境中去寻找,提出的问题 如何寻找耐高温的酶？解决问题的思路 寻找耐高温环境；原理 高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，耐高温菌种提取耐高温酶。,（二）实验室中目的菌株筛选,原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。,
2、回答：1、在该配方中，为微生物生长提供碳源和氮源的是什么物质？2、绝大多数的微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，请分析该培养基是否对微生物有选择作用？如果有，是如何进行选择的？,葡萄糖、尿素,只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上,（三）选择性培养基:在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞,分解尿素
3、细菌分离设计:,二、统计菌落数目,1直接计数法：最常用显微镜直接计数法。先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。缺点：不能区分死菌和活菌；难以计数微小的细菌。一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。,2间接计数法：最常用稀释平板计数法。,原理：1个活菌1个菌落统计原则 选 30300 个菌落的平板统计 每个稀释度取3个平板取其平均值,注意：菌落计数偏差1、统计的菌落数比活菌的实际数目 低。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是 一个 菌落。因此，统计结
4、果一般用 菌落数 来表示。2、显微镜直接计数活菌的实际数目 高。这是因为计数时连同死亡菌体一同计数。,每克样品中的菌株数（CV）MC：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积（ml)M：稀释倍数,三、对照设置,设置对照的主要目的 是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了 被测试 的条件外，其他条件都 相同 的实验。满足该条件的称为 对照组，未满足该条件的称为 实验 组。,思考6原因：土样不同，培养基污染或操作失误（或者是混入了其他的含氮物质)请设计本实验的对照实验组：方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。方案2：A同学以不接种
5、的培养基作为空白对照。,四、实验设计,实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。实验流程：,1、土壤取样土壤微生物主要分布在距地表38cm的近中性土壤中，约7080为细菌。,2、样品稀释并涂布分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板。细菌稀释度为104、105、106，放线菌稀释度为103、104、105，真菌稀释度为102、103、104。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不
6、精确，需要重新实验。,3、微生物的培养与观察1）培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在3037培养12d，放线菌一般在2528培养57d，霉菌一般在2528的温度下培养34d。2）在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。3）菌落的特征包括 形状、大小、隆起程度、颜色 等方面。,注意：菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增值慢，所以培养时间要充足，使得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是
7、区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,4、鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生物的生存 酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红脲酶阳性,五、实验过程注意,1）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。2）应在火焰旁称取土壤 10 g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。4）实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。5）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。,六、结果
8、分析与评价,1对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助 生物化学 的方法。2在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的 脲酶 将尿素分解成了 氨。氨会使培养基的碱性 增强，PH 升高。因此，我们可以通过检测培养基 pH 变化来判断该化学反应是否发生。3在以 尿素 为唯一氮源的培养基中加入 酚红 指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变 红，说明该细菌能够 分解尿素。,思考10测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现 黑 色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。你认为在该实验中至少应取 三 个水样。,及时训练,1、实验测
9、定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂块平板上画3条等长的平行线（3条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于37条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析以下叙述，不正确的是（）A链霉素能阻止结核菌的生长 B链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效C链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效 D链霉素可以用于治疗伤寒病人,D,2、影响微生物生长的主要环境因素是A阳光、温度、水分 B温度、水分、PH C水分、PH、氧 D温度、PH、氧3、可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是：（）A、以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂 B、以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂C、以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹试剂 D、以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂4、可用于菌落数目统计的培养基是（）A 固体培养基 B液体培养基 C半固体培养基 D天然培养基,D,A,A,5、高压蒸气灭菌的原理是（）A高压使细菌DNA变性 B高温使细菌蛋白质凝固变性 C高温烫死细菌 D高温使细菌DNA变性,B,B,
