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1、最新：群体感应调控细菌耐药的机制（全文）细菌的抗菌素耐药已成为威胁人类健康的重大问题，亟需新策略阻控细菌耐药。群体感应是微生物细胞间交流的一种机制，当环境中群体密度达到阈值后群体感应即被激活，调控下游基因转录。群体感应已被证实可调控生物膜、外排泵、细菌分泌系统等抗菌素耐药机制，有望成为耐药调控靶点。目前已有多种群体感应抑制剂通过降解信号分子、干扰信号分子与受体蛋白的识别和结合、阻断群体感应信号的合成等方式干扰群体感应。群体感应抑制剂有望成为阻控微生物耐药的新方法。近年来，随着抗菌素的广泛使用，细菌的抗菌素耐药已成为威胁人类健康的重大问题。研究者们试图通过研究微生物耐药靶点、研发新型药物等方法攻
2、克抗菌素耐药这一世纪难题，但细菌耐药率仍逐年攀升。因此，迫切需要从新的角度研究抗菌素耐药问题。最近，一些研究揭示了群体感应（quorumsensing）系统在细菌耐药中的作用，并深入探索了群体感应调控细菌耐药的机制，这些研究成果有望为阻控抗菌素耐药提供新的方法和靶点。本文围绕群体感应对细菌抗菌素耐药的调控机制及干预手段进行综述。一.细菌耐药机制目前，抗菌素的作用机制主要包括以下4个方面：（1）阻碍细胞膜合成；（2）增强细胞膜通透性；（3）影响蛋白质合成；（4）干扰DNA的复制和转录】。相应地，细菌发展出以下5种主要抗菌素耐药机制：（1）降低细胞膜对抗菌素的通透性；（2）利用外排泵排出抗菌素；（
3、3）基因突变或修饰抗菌素靶向基因；（4）对抗菌素的直接修饰或降解；（5）形成生物膜1W。为克服细菌耐药，新药研发、药物联用已成为常见手段，但罕有从细菌群体角度出发制定的策略。基于此，深入研究细菌群体感应系统，从中寻找新的耐药阻控手段已刻不容缓。二、群体感应简介20世纪70年代，Nea1.son和Eberhard等【2,3发现费氏弧菌（Vibiofischeri）和哈维弧菌（Vibioharveyi）的发光现象可由菌群密度所调控,这是最早关于群体感应现象的文献报道。1994年，Greenberg教授在总结费氏弧菌、根癌农杆菌、胡萝卜软腐欧文菌、铜绿假单胞菌等细菌的群体行为基础上，率先提出群体感应
4、这一概念4。群体感应是指微生物通过监测种群密度调控群体行为的生物现象。微生物分泌可扩散的信号分子并在环境中累积。在低细胞密度时，外部环境中的信号分子浓度较低，不发生群体感应调控；在高细胞密度时，外部环境中的信号分子累积至一定浓度，与受体蛋白结合，启动下游基因转录，调控种群性状4。不同细菌有不同的群体感应系统。大部分革兰阴性菌的群体感应系统为1.uIR型系统。1.UX1./R型系统的原型为费氏弧菌群体感应系统，其中编码酰基高丝氨酸内酯（acy1.homoserine1.actone,AH1.）N-（3-氧代己酰基）-1./V-(3-oxo-hexanoy1.)-1.-homoserine1.ac
5、tone,OHH1.的合成,IuxR编码AH1.依赖性转录因子S。其他革兰阴性菌群体感应系统与其相似，/同源基因编码AH1.信号分子合成，信号分子自由扩散并与1.uxR同源性受体蛋白结合，调控下游基因转录。如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)中的IaS1.与AyM具有同源性JasI编码合成N-3一氧十二烷酰-高丝氨酸内酯N-(3-oxododecanoy1.)-homoserine1.actone,30C1.2-HS1.信号分子，而与ox?同源的IaSR是PA毒力基因的全局调节剂5。PA中的另一套重要群体感应系统RhII/R也包含了同源的M及同源的rh/R51。大
6、肠杆菌与沙门菌含1.uxR同源蛋白SdiA,但无1.uxI同源蛋白，故SdiA起到感应环境中信号分子浓度变化的作用6。与革兰阴性菌不同，革兰阳性菌群体感应系统的信号分子主要为自诱导肽(autoinducerpeptide,AIP),需要通过ABC转运系统(ATP-bindingcassette)或膜通道蛋白实现胞内外转运。自诱导肽长度为517个氨基酸U,通过磷酸化级联反应进行信号转导。当环境中的自诱导肽浓度达到一定阈值后，与细胞膜上的双组分信号转导系统自诱导肽受体结合，组氨酸蛋白激酶被激活，激酶中的组氨酸残基磷酸化，磷酸基团进一步通过天冬氨酸残基被传递给受体蛋白，磷酸化后的受体蛋白与DNA结合
7、调控下游基因表达181。止匕外，革兰阳性菌还存在一种AI-2信号系统，其信号分子是一类吠喃酰硼酸二酯，该信号分子合成基因oxS在革兰阴性、革兰阳性菌中均较保守，故该系统被认为是物种间交流的调控途径。研究较多的革兰阳性菌群体感应系统为金黄色葡萄球菌(Staphy1.ococcusaureus,SA)的Agr系统。在SA中，agr?编码自诱导肽前体肽AgrD,AgrB对AgrD进行处理，将自诱导肽分泌至胞外。即/编码组氨酸蛋白激酶AgrC,与agrA编码的AgrA组成双组分信号转导系统。AgrA能结合启动子P2、P3进行转录调控群体感应可调控细菌的多种生命活动，如生物发光、细菌运动、致病基因表达、
8、毒力因子合成等。研究发现，群体感应通过调控生物膜形成、外排泵表达、细菌分泌系统等机制调控细菌的抗菌素耐药。下文将以革兰阴性菌PA、革兰阳性菌SA为例，详细阐述群体感应调控细菌抗菌素耐药的机制研究进展。三.群体感应调控微生物耐药的机制研究进展1.群体感应调控PA耐药的机制研究进展：多种结构性肺病患者呼吸道内均可见PA定植，如慢性阻塞性肺疾病1。、支气管扩张症【I】、囊性肺纤维化等112,且PA定植与急性加重有关10，13,14o感染是结构性肺病患者急性加重的主要诱因反复使用抗菌素引起的PA耐药已成为临床治疗的重要难题。同时，PA作为经典革兰阴性菌，其群体感应系统已被深入研究，群体感应与抗菌素耐药
9、的关系及机制被部分揭示。PA主要有以下几个群体感应系统：1.as1./R系统、RhI1./R系统、B诺酮信号(Pseudomonasquino1.onesigna1.zPQS)系统、集成群体感应信号(integratedquorumsensing,IQS)系统(图1)。如前文所述，1.as1./R、RhII/R系统属1.ux1./R型系统，其信号分子分别为3OC12-HS1.和C4-HS1.o1.as1./R系统激活后促进下游大量基因的转录，如taskrhkMR、pqsR、pgs8C。等，调控碱性蛋白酶、弹性蛋白酶、外毒素A等毒力因子表达15。RhI1./R系统调控弹性蛋白酶合成、鼠李糖脂合成
10、、吩嗪代谢等生化进程151。PQS系统信号分子为2-庚基-3-羟基-4Dt诺酮(2-hepty1.-3-hydroxy-4-quino1.one),其前体为2庚基-4-瞳诺酮(2-hepty1.-4-quino1.ones,HHQ)。HHQ和PQS与PqsR结合,PqSR与pgs8COE操纵子的启动区域结合调控下游绿脓素合成等15。IQS系统信号分子为2-(2-羟苯基)睡嘤4甲醛2(2-hydroxypheny1.)-thiazo1.e-4-carba1.dehydeo在环境中磷酸盐耗竭的情况下JQS能替代1.as1./R系统进行群体感应的全局调控16Pseudoaonasaerugiosa
11、1.ul/RMttPQSKtt图1铜域假单胞带和金黄色劭笥辣带群体感应系线PA群体感应可从多方面调控耐药。1998年，Greenberg教授课题组率先发现PA1.as1./R群体感应系统调控生物膜形成正常形态E171.SakUragi和KOIter通在此基础上提出，1.as1./R系统可能通过控制胞外多糖产生的夕H基因调控生物膜形成。Ueda和Wood进一步研究了其中的机制发现1.as1./R群体感应系统正向调控/6/的表达,TpbA具有酪氨酸磷酸酶活性，能使TpbB去磷酸化，引起c-di-GMP减少。c-di-GMP通过与PeID蛋白结合增强胞外多糖的产生，因此c-di-GMP减少导致胞外多
12、糖的产生受抑从而减少生物膜的形成I，细胞外DNA是生物膜的主要成分，群体感应能通过调控细胞外DNA水平调控生物膜形成。AiIeSen-H。Im等2。】发现，PQS群体感应系统介导噬菌体诱导、菌毛/鞭毛依赖的细胞裂解,调控细菌DNA释放，从而影响生物膜的形态和结构。外排泵是细菌的一种重要耐药方式，而群体感应与外排泵的调控是相互的。一方面，PA群体感应系统调控外排泵基因的表达。例如，外源性添加RhII/R群体感应系统信号分子C4-HS1.能引起由mex厂介导的外排泵MexAB-OprM基因表达上调I】。另一方面，外排泵能泵出群体感应信号分子。例如，外排泵MexCD-OprJ的过表达会增加PQS前体
13、HHQ的泵出从而抑制PQS群体感应系统2。细菌分泌系统(secretionsystem,SS)可从细胞内排出蛋白质、DNA,在细菌间遗传信息传递过程中发挥作用。目前在细菌中已发现以下8个分泌系统：T1SS、T2SS、T3SS、T4SS、T5SS、T6SS、T7SS和T9SS-31T1.SS与鲍曼不动杆菌、肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、PA等多种病原体的耐药密切相关24,在PA中，T1.SS的效应器碱性蛋白酶AprA的表达依赖于群体感应25。PA的T2SS受群体感应调控，例如：1.aSR蛋白与3OC12-HS1.结合能激活X。P和x?转录6；在产生C4-HS1.缺陷的突变株中，T2SS的xcpx?表达
14、水平下降26。T3SS则受RhII/RhIR系统负向调控C4-HS1.与RhIR结合后引起T3SS下调而/?中可观察到exoS过表达27。2.群体感应调控SA耐药的机制研究进展:SA主要含2种群体感应系统：Agr系统和1.UXS/AI-2系统。在Agr系统中，启动子P2、P3分别启动RNAn、RNAIn的转录。RNAn编码agrB.agrD、agrCagH四个开放阅读框。吆小产生自诱导肽前体，经过AgrB加工和分泌形成自诱导肽。自诱导肽与跨膜受体AgrC结合，触发双组分系统磷酸化,引起AgrA磷酸化。AgrA与RNAI1.和RNAnI的启动子位点结合,其中RNAn1.诱导毒力基因表达,RNAn
15、进一步促进自诱导肽合成，形成正反馈环路28。Agr系统能调控多种毒力因子基因：RNA1.n刺激毒力因子-毒素的产生，同时通过抑制。1基因抑制蛋白酶、脂肪酶、蛋白A、肠毒素等表面毒力因子29。除Agr系统外，SA的群体感应系统还包括1.uxS/AI-2系统。AI-2是一种重要的种间信号分子，需要指出的是，在SA的群体感应系统中,uxS调控AI-2的合成，但SA无AI-2受体。Agr系统和1.uxS/AI-2系统主要通过调控生物膜影响SA耐药。Agr群体感应系统主要影响生物膜的分散，agr突变体能形成更厚的生物膜30。Agr系统也可以通过干扰蛋白酶来影响生物膜形成131】。细胞间黏附是形成生物膜的
16、必备步骤，1.uSAI-2通过抑制生物膜形成正调控因子Z抑制生物膜产生。1.UXS缺失引起死尸转录水平上升，多糖细胞间黏附(po1.ysaccharideinterce1.1.u1.aradherence,PIA)增加，生物膜形成增加32o/ca操纵子包括icaA、icaB、icaC、icaD,控制PIA的产生33。AI-2激活/B/?转录，抑制ica操纵子,从而抑制生物膜形成33。另外，1.uxS/AI-2还能通过调节VraS/R双组分系统调控SA对万古霉素的耐药。xS的缺失能引起VraS/R双组分系统上调，且SA对抑制细胞壁的抗菌素抗性增加；添加AI-2,SA敏感性恢复34,但其具体机制需
17、要进一步研究。四.利用群体感应淬灭剂防控抗菌素耐药群体淬灭是通过干扰微生物的群体感应系统而防御病原菌感染的一种机制，能实现群体淬灭的化合物称之为群体感应抑制剂(quorumsensinginhibitor1.QSI)群体淬灭主要有如下3种方式(图2)。降解信号分子干扰信号分子与受体蛋白的识别结合阻断信号合成通路AH1.幽化薛脱氨犀群体感应抑制剂信号合成蛋白图2QSI抑制群体感应的三种机制示意图1.降解信号分子：目前已知有4种酶能降解信号分子：AH1.内酯酶和脱竣酶水解内酯环，AH1.酰化酶和脱氨酶切割酰基侧链35。信号分子降解酶可来源于原核生物、动植物，广泛应用于群体感应研究，其中常用的包括：
18、AH1.内酯酶AiiA36；猪肾酰化酶If能使N-酰基高丝氨酸内酯脱酰，可用于灭活3OC12-HS1.和C6-HSU37。2.干扰信号分子与受体蛋白的识别结合：干扰信号分子与受体蛋白的识别、结合，通常是通过修饰信号分子的手段进行的。AH1.信号分子的生物活性受几何形状、手性、酰基侧链长度的影响35,修饰可在HS1.头部或酰基尾部进行。人工合成的信号分子类似物起到受体拮抗的作用，可阻断群体感应环路，达到QSI的效果。从这个角度出发，研究者们合成了多种QSI,包括：N-环烷基或N-芳基胺类、HS1.类、高半胱氨酸内酯类或3-氨基-2-恶理烷酮核心类38。例如，N-酰基环戊基胺（N-acy1.Cy1
19、.openty1.amines,Cn-CPA）是一类针对PA的QSI,其中C1.O-CPA对1.as1./R系统和RhII/R系统抑制能力最强9o用环烷基、芳基、杂芳基胺取代HS1.得到的N-（2羟基环戊基）、N-（2-氧环己基）和N-（2-羟基苯基）衍生物都能有效拮抗1.asR38。在3OC8-HS1.的HS1.环的第3、4位进行取代彳导到类似吠喃酮的结构，该产物能有效抑制群体感应4。3OC12-HS1.类似物N-（2氧代环己基）-3一氧代癸酰胺也能有效抑制群体感应Mi。同理，在SA的Agr群体感应系统中，截短型AI-2因其能与受体结合但不激活群体感应通路，能作为一种良好的QSIM2。另外，
20、在AP2介导的群体感应系统中,AI-2分子类似物己基-4,5二羟基-2,3-戊二酮可作为QSI使用43。3.阻断群体感应信号的合成通路：昧喃酮化合物C-30抑制PA中编码邻氨基苯甲酸合酶的夕万/8操纵子的转录，参与PQS信号的生物合成44。亚致死剂量的阿奇霉素能有效抑制PA中3OC12-HS1.合成基因dS的转录45。研究表明，通过阻断或干扰细菌群体感应，能有效阻遏细菌耐药。1.i等46在PA中加入信号分子淬灭剂猪肾酰化酶，在亚致死剂量氨莘西林胁迫下进行耐药进化实验，发现QSI显著增加了PA对氨节西林的敏感性。QS1.与抗菌素协同使用，有增加抗菌素敏感性、减少用量的作用47,48,从而减少细菌
21、抗菌素暴露，也能阻遏耐药。可见，干扰细菌群体感应有望成为新的耐药阻控手段。虽然QSI种类繁多且已被证明切实有效，但距离QSI应用于临床防治细菌耐药仍有较长的距离，仅有一些初步临床前研究和临床研究。内酯酶SsoPox-I能抑制PA的1.as1./R系统，降低/8活性、绿脓素合成、生物膜形成，吸入SsoPox-I将急性肺炎大鼠死亡率从75%下降至20%49,但其在人体的作用未被证实。其他研究主要聚焦于QSI复合材料用作导管涂层，抑制置管期间导管源性感染。将QSI味喃酮与苯乙烯聚合物、I-乙基-3-（二甲基氨基丙基）碳二亚胺交联制作的导管涂层，能在动物模型中有效控制感染15。】。5-氟尿嚓碇体外能抑
22、制PA群体感应调节的毒力因子，可抑制细菌生长，用作危重患者导管涂层51。另有临床研究聚焦于QSI大蒜素胶囊治疗囊性纤维化患者的临床效果，该研究发现服用大蒜素的实验组临床评分相对对照组无显著性差异,但未能详细讨论QSI对调节呼吸道菌群耐药的情况52o综上，QSI的临床应用研究仍处于起步阶段，需要大量探索。目前QSI应用的难点主要集中在以下几个方面：（1）部分QSI水溶性差、结构不稳定，需要寻找针对性剂型和药物递送方法；（2）缺乏大宗临床研究数据；（3）QS1.阻控耐药往往需要长期应用，可能存在依从性低下的问题；（4）气道内微生物群落结构复杂，QSI往往只能作用于同一类群体感应系统，难以应对真实世界复杂的菌群结构。如若有效解决上述问题，QSI有望广泛应用于临床防治细菌抗菌素耐药。五.总结群体感应作为一种微生物交流的方式，在细菌社会行为调控方面有着巨大的应用潜力。群体感应通过调控生物膜、外排泵、分泌系统等方式调控细菌抗菌素耐药，其分子机制有待进一步研究。QSI能抑制细菌耐药、促进抗菌素增敏，具备临床应用价值。期待日后的研究深入揭示群体感应调控机制，研发更多新型QSI及复合材料，让QSI真正走向临床应用。
