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1、一、目的,1.1了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理1.2掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法,二、原理,各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。不同微生物因具有不同的酶系统，分解利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，其发酵的类型和产物也不相同。细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中有很大作用。,三、材料,3.1菌种大肠杆菌（Escherichiacoli）产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）普通变形杆菌（Proteusvulgaris）枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的斜面菌种 3.2培养基 糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）、葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水
2、培养基、淀粉培养基、H2S试验培养基、柠檬酸盐培养基3.3试剂 V.P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示剂、碘液。3.4器具 恒温培养箱、试管、移液管、杜氏小管。,四、步骤,(一)糖类发酵试验（二）乙酰甲基甲醇试验(VP试验)（三）甲基红试验（M.R.试验）（四）吲哚试验（五）柠檬酸盐试验（六）硫化氢试验（七）淀粉水解试验,(一)糖类发酵试验,原理 可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，(乳酸、醋酸、丙酸等)可在糖发酵培养基中加入指示剂，经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，(甲烷、氢、二氧化碳等)可在发酵培养基中放入倒置杜氏
3、小管观察。材料菌种：大肠杆菌、变形杆菌 培养基：配方：蛋白胨水培养基：蛋白胨 10g NaCl 5g 水 1000mL pH 7.6 121 20分钟。葡萄糖发酵培养液：(蛋白胨水培养基 1000mL 酸性复红水溶液 25mL pH 7.6)乳糖发酵培养液试管 另配：20糖液(葡萄糖、乳糖、蔗糖)115灭菌30min 制法：1、将上述含指示剂的蛋白胨水培养基分装于试管中，每管10mL，内加杜氏管 121灭菌25min。2、灭菌后，以无菌操作每管分别加入20的无菌糖液0.5mL(1的浓度)即为不同的糖发酵液配养基。3、0.5酸性复红水溶液100mL+1N NaOH16mL,步骤 1试管标记取分别
4、装有葡萄糖和乳糖发酵培养液试管各2支，(如设空白取3支)每 种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、普通变形杆菌。2接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中。置37恒温箱中培养，培养24h-48h，观察结果。,与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“”表示。,结果观察,（二）乙酰甲基甲醇试验伏-普(Voges-Proskauer二氏)V
5、P试验 原理 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇(CH3.CO.CHOH.CH3)，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V.P（+）反应。材料 菌 种:大肠杆菌（Escherichiacoli）、产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）培养基：葡萄糖蛋白胨水培养液 配方：葡萄糖 5g 蛋白胨 5g K2HPO4 2g H2O 1000 ml PH 7.07.2 115灭菌30min 步 骤 1标记试管:取2支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌。2接种培养:以
6、无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中。置37恒温箱中，培养2448h。,取出以上试管，振荡2min。加入等量V.P试剂；振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37恒温箱中保温1530min。,若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“”表示）。,结果观察,（三）甲基红试验（M.R.试验）,原理 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基pH值下降至pH4.2以下，培养液由原来的桔黄色，使甲基红指示剂变红。材料 菌种 同V.P试验
7、 培养基 同V.P试验步骤 同V.P试验1标记试管:取2支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌。2接种培养:以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中。置37恒温箱中，培养2448h。,取出以上试管，各加入23滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层。若培养液上层变成红色，即为阳性反应，用“”表示；若仍呈黄色，则为阴性反应，用“”表示。,结果观察,（四）吲哚试验,原理:有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛试剂）时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚(红色化合物)。材料菌种：同
8、VP试验 培养基：蛋白胨水培养基 试剂：二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。步骤 1试管标记:取装有蛋白胨水培养液的试管2支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌。2接种培养:以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，置37恒温箱中培养2448h。,取出以上试管，在培养液中加入乙醚12ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入510滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察）。如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“”、阴性用“”表示。,结果观察,（五）柠檬酸盐(利用)试验,原理有些细菌能够利用柠檬
9、酸钠作为碳源，如产气肠杆菌；而另一些细菌则不能利用柠檬酸盐，如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐后，产生碱性化合物，使培养基的pH升高，当培养基中加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时，就会由绿色变为深蓝色。（溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH小于6.0时呈黄色，pH在6.07.6时为绿色，pH大于7.6时呈蓝色。）材料菌种：同VP试验 培养基：柠檬酸盐培养基（固体斜面）配方：NH4H2PO4 1g K2HPO4 1gNaCI 5g MgSO4 0.2g 柠檬酸钠 2g 琼脂 16g 水 1000mL 1溴麝香草酚蓝(酒精液)10mL PH 6.8。加热溶解后调PH，然后加入指示剂 121灭菌25min步骤 1试
10、管标记 取装有柠檬酸盐培养基固体斜面的试管2支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌。2接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管斜面上做“之”字形划线，置37恒温箱中培养2448h。,结果观察,培养基颜色由绿色变为深蓝为阳性，不变者为阴性。,（六）硫化氢试验,原理有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢一遇培养基中的铅盐或铁盐等，就形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。材料菌种：大肠杆菌、变形杆菌 培养基：H2S试验培养基（固体）步骤 1试管标记:取装有H2S试验固体培养基的试管2支，分别标记大肠杆菌、变形杆菌。2接种培养:以无菌操作分别用接种针挑取少量菌苔到以
11、上相应试管做穿刺接种，置37恒温箱中培养2448h。,结果观察,（七）淀粉水解试验,原理有些细菌可产生淀粉酶水解培养中的淀粉为糊精，或进一步水解为麦芽糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝。材料菌种：大肠杆菌、枯草杆菌 培养基：淀粉培养基（固体）(pH值:7.2)配方:每升培养基含 蛋白胨:10g 牛肉膏:5g NaCl:5g 可溶性淀粉:2g 琼脂:20g,（七）淀粉水解试验,步骤 1培养皿标记 取装有淀粉培养基（固体）的培养皿一只，在培养皿两侧分别标记大肠杆菌、枯草杆菌。2接种培养 以无菌操作分别用接种环挑取少量菌苔到培养皿相应部位做十字接种，置37恒温箱中培养2448h。,结果观察,取出平板，加上少
12、量碘液，轻轻摇动，使碘液铺满平板表面，观察菌落周围是否出现透明圈及圈的大小。,六实验结果与分析,1 配制培养基,糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）葡萄糖蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基淀粉培养基色H2S试验培养基柠檬酸盐培养 每组配制一种培养基,300mL.,实验内容及分工,时间安排,2 灌装试管,糖发酵培养基（葡萄糖）-水培养液糖发酵培养基（乳糖）-水培养液葡萄糖蛋白胨水培养基-水培养液蛋白胨水培养基-水培养液柠檬酸盐培养（固体斜面）H2S试验培养基（固体）淀粉培养基 每组每种培养基装3只试管.作好标记(培养基名称,组别,接种微生物,日期).淀粉培养基用三角瓶装好,灭菌后倒平板.,3 灭菌(集体进行),4 摆斜面,倒平板(分组进行),5 接种(分组进行,每组14支试管,2个平板),6 置37培养箱培养,7 实验结果观察:24-48h后,
