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1、前 言,组织培养技术的应用,基础研究工业化生产,Park IH,et al.Cell.2008 Sep 5;134(5):877-86.,病毒组织培养疫苗生产,基因工程产品,层析 和 超滤,分离、浓缩生物大分子 常用的手段,试管婴儿,静止培养,旋转培养,振荡培养,生物反应器高密度培养,厌氧培养,一、细胞培养方式,二、体 外 培 养 的 分 类,体外培养 in vitro细胞培养 Cell culture 组织培养 Tissue culture 器官培养 Organ culture,体外培养种类,细胞培养（Cell culture）,培养物是单细胞或群体细胞 模拟体内生理环境，在无菌、适当的温度
2、和一定的营养条件下，使之生长生存维持结构和功能的培养方法。,组织培养（Tissue culture）,方法同上，使用组织块(0.5-1mm3)或薄片(0.2mm),器官培养（Organ culture）,应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法使用器官原基或器官的一部分或整个器宫,三、组织与细胞培养的优缺点,优点：能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动；可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作便于观察、记录、摄影，直接观察细胞变化 可供研究的细胞种类广泛，从低等生物到高等动物，以及人类；从胚胎到
3、成体；从正常组织到肿瘤细胞皆可 便于使用不同方法研究细胞（相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、组织化学和同位素标记等）,培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组，是分子生物学和基因工程学的研究对象和组成部分可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少，经济易于施加物理、化学和生物因素进行实验 已成为生物制品、基因工程制品、单克隆抗体生产的必要手段,局限性：组织和细胞离体以后，独立生存在人工培养环境中，与体内环境相比，仍有很大差异。故实验结果不能推至体内，轻易做出与体内等同的结论,四、组织与细胞培养的细胞生物学特点,体内外细胞的差异：当人工条件和体内实际情况不完全相同时，细胞在体外培养后，一旦失去神
4、经体液调节和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖（Atavism）现象，即失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱、细胞趋单一化、不死性、恶性状态。细胞增殖和分化：是细胞生命进化中所获得的基本属性，增殖使细胞数量增多；分化使机体结构和功能多样化，最后演变成完整的有机体。,五、培养细胞的状态,贴附型能贴附在支持物表面生长。大多数培养细胞呈贴附性生长；只依赖于贴附才能生长贴附后，易失去其原有的特征，细胞分化现象常不显著。在形态上表现单一化的现象，并常反应其胚层起源，呈现类似“返祖现象”成纤维型细胞、上皮型细胞、游走型细胞及多形型细胞 悬浮型,成纤维型细
5、胞细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状 成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、骨髓基质干细胞等,上皮型细胞扁平不规则多角形，中有圆形核，细胞紧密相连成单层膜消化管外皮细胞、肝、胰、肺泡上皮、血管内皮等,游走型细胞在支持物上散在生长，一般不连接成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快而且不规则神经胶质细胞,多形型细胞难以确定其规律和稳定的形态 神经组织细胞,悬浮型见于各种造血系统肿瘤细胞和血液细胞胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长容易大量繁殖,六、培养细胞生长的条件,营养生存环境温度:37 O2CO2:5%CO2+H2O H2CO3 H+HC
6、O3-pH:7.0-7.2 渗透压无污染无毒,组织培养室的设施及条件,压力蒸汽消毒器：湿热消毒。用途广电热干燥箱：干热消毒（160，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒 滤器：过滤除菌。大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒,七、无 菌 操 作,无菌室的灭菌定期打扫无菌室实验前灭菌实验后灭菌实验人员的无菌准备肥皂洗手穿隔离衣酒精棉球擦手,无菌操作中常犯的错误,吸管、剪刀等碰到其他器皿,无菌操作中常犯的错误,正确的拿管姿势,错误的拿管姿势,拿吸管时手碰到无菌区,无菌操
7、作中常犯的错误,培养基浸湿吸管底部的棉花,八、细 胞 和 组 织 培 养,将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。1、组织块培养 直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。2、细胞培养 一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。,计 数 细 胞,细胞数/ml=计数16格稀释倍数 104,细胞数/ml=计数16格个数/个数稀释倍数104,培养细胞的观察,每隔一定时间观察一次是否生长良好形态是否正常有无污染培养基的PH是否太酸或太
8、碱（由酚红指示剂指示）定时检查培养温度和CO2浓度,概 念,原代培养 直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为原代培养，而改称为细胞系。传代培养 细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。,取 材,理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。,细 胞 培 养 的 准 备
9、工 作,九、原 代 培 养,组 织 块 法,新鲜取材的组织中 细胞仍具有分裂增殖的能力。将组织切成小块培养在模拟体内的环境中，小块组织的细胞可以游离出来，从培养液中吸取营养，继续分裂生长。组织块培养法适用范围广，常用于肝脏、皮肤、角膜、骨骼、韧带、血管、神经、心脏等器官和组织的培养。,培 养 要 点,材料新鲜严格无菌操作剔除脂肪等附着组织组织块剪小（直径1mm）摆放开（间距5mm）,常 犯 的 错 误,操作中不换器械冲洗次数不够组织碎片太大组织块摆放太密培养液加入太多,消 化 培 养 法,消化培养法所用的酶有多种，目前应用最广的是胰蛋白酶。它是一种内切酶，可专一水解有精胺酸或赖氨酸的羧基形成的
10、肽键。从而消除妨碍细胞生长的细胞间质，包括基质、纤维等，使细胞分散，易于贴壁并从外界吸收养分和排除代谢物。消化法适用于组织量大的原代培养。胰蛋白酶液适用于消化间质少的组织，如羊膜、胚胎、上皮、肝和肾等组织及传代细胞。,培 养 要 点,组织剪碎至1mm3左右合适的胰蛋白酶浓度（通常为0.25%）合适的消化时间：消化时，待组织块变得较疏松，颜色略白为止（通常为37，2040分钟）,常 犯 的 错 误,水浴锅未预热,组织块太大,胰蛋白酶消化不足或过度,吹打用力过重,常 犯 的 错 误,十、传 代 细 胞 培 养,细胞在原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的操作叫传代。为获得稳定的细胞株，或大量的同种细
11、胞，当培养细胞形成致密的单层后需进行传代培养。,细 胞 传 代 方 法,根据细胞生长的特点，传代方法有3种悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l/22/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液,贴壁生长细胞传代方法,吸光培养瓶中的培养液PBS洗一次加入12 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2
12、10 min（显微镜下动态监测）吸去胰蛋白酶液，加入培养液用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内将后者放入培养箱中培养,Trypsin消化细胞,未消化细胞,消化的细胞,培 养 要 点,严格的无菌操作适度消化,细胞培养中需要注意的问题,培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度PH：初培养pH应为7.4，培养过程应不低于7.0培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10,细胞培养中需要注意的问题,容积、深度、表面面
13、积：培养液体积与表面面积的比例为0.20.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培养液（2mm）中生长较好；需要低浓度氧的,在深的培养液（5mm）中生长较好。去除死细胞温度控制：动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于36.5，细胞生长缓慢；温度高于37.5，细胞存活力降低,十一、细 胞 冻 存 和 复 苏,细胞冻存的意义,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化,冻存细胞的理论基础,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不
14、致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶,冻存和复苏的原则,慢 冻 快 融,细 胞 冻 存 方 法,预先配制冻存液：90%血清 10%DMSO（二甲基亚砜）取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（11065106细胞/ml)加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期,慢 冻 程 序,标准程序当温度在-25 以上时，12/min当温度达-25 以下时，510/min当温度达-100时，可迅速放入液氮中简易程序 将冻存管于4放置1小时，于-20放置1小时，-80放
15、置1小时/通过线绳将装有冷冻管的纱布袋固定于液氮罐罐口（-70），放置1小时，后直接投入液氮中（-196）,细 胞 复 苏 方 法,从液氮中取出冻存管，在3738水浴中快速使其融化（1分钟左右）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上低速离心10分钟去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞,十二、ATCC入库细胞要求,培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等 冻 存 液：培养基和防冻液名称细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性培 养 液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长
16、特性核 型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等物种检测：检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测免疫检测：一两种血清学检测细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名,中国典型培养物保藏中心,中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)于1985年由中国专利局指定、经国家教委批准建立的专利培养物保藏机构，受理国内外用于专利程序的培养物保藏。保藏的培养物包括细菌、放线菌、酵母菌、真菌(含酵母菌)、单细胞藻类、细胞系，植物组织培养、植物种子、动植物病毒、噬菌体、载体和基因文库等各类培养物,谢 谢！,
