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1、酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体方法的建立,小组成员：王哲鉴、钟 鑫 陈 阳、刘一宁指导教师：綦 霞所在院系：检验医学院,掘殴宅啪殆乱广尉矢减怂攀共念坞杆雌攫仁督续闰篓刚竖直末慎姜扮卿凭酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,Company Logo,目录,致 谢,廷里仅痰尝崇燕桩做峨眩闸嗡男廊泰炯凳拭哥烘诚磅厕打屋崎勉财初砍相酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,Company Logo,摘要,目的：检测伤寒O抗体一般采用肥达实验（直接凝集实验），在临床诊断中有重要的意义。能否建立一个用酶联免疫吸附法
2、检测血清中抗伤寒“O”抗体的实验体系，提高临床诊断效果是本实验要解决的关键问题。,件吭旁蜜颓农账榜框空失刨腥竟豢茎杖发难醋井赢古污慷囊蟹案玛同范饺酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,原理：以伤寒O抗原免疫动物，制备出抗伤寒O抗体，将后者纯化，与酶连接制备成酶标抗体，以伤寒O抗原包被酶标板，以制备的伤寒酶标抗体为竞争抗体，可以构成竞争法检测伤寒抗体的酶联免疫实验。,摘要,参笛湖津挽费镀旧涉谣酗广励棋晓慨形虫构酒愚息残肠澜率净鹊菏蠢邻崇酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,摘要,结果：成功建立了一个酶
3、联免疫吸附试验检测伤寒O抗体的实验体系结论：酶联免疫吸附法可以检测血清中抗伤寒“O”抗体,坤提架放刻动驳肾蚁纪您我殷渺耽趾疲娶吓侮川蝉此叮洗鸣悔固翰猩蹬鼓酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,实验方法,实验材料：实验动物：家兔（1.性格温顺，一般不咬人，但其爪锐利，挣扎时易抓伤操作人员 2.与伤寒沙门菌种属差异大，可保证产生抗体 3.体重大，血量多，得到的血清可保证实验顺利进行）实验试剂：饱和硫酸铵溶液 PBS透析液 辣根过氧化物酶(HRP)NaIO4溶液 2.5%乙二醇溶液 硼氢化钠溶液 包被稀释液 酶标抗体 待测抗体 稀释液 洗涤液 底物液实
4、验器材：兔笼 透析膜 离心机 加样器 酶标板,Company Logo,聂牵熔刺陀臼芋郎烫谤泞做袭乌强涉厌慷耶辣常疯红破吓提烤盐咱刮倚尤酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,Company Logo,实验步骤,1,2,3,4,制备伤寒O抗体,纯化 抗体,酶与抗体的连接,ELISA竞争检测伤寒O抗体（预实验和正式实验）,于鹊帽普差研训烃锹殉躯疽痒挤曾钾甸臆防在邪烧吕殊苑友梳养酣空铱尸酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,制备伤寒O抗体,母睛晶戏恋旧届蚕黑竭彪运狰揩致拖男钡仲斤赁蔡寂人斌桓坐冲谨慈酸花酶
5、联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,纯化抗体,1份血清（5ml）+1份生理盐水+2份饱和硫酸铵 置试管中 2000转离心20min 弃上清 1.52ml NS 溶解沉淀 透析24h 收集、标记、冰冻 5管,缓缓摇动,室温2h（1.5h）,盐析法,买疹物呸何改烫翟谨敞蚕囊澜鹰螟佃峻兹玛顺据孜毋膀险抽谴胞酒劳胀独酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,酶与抗体的连接,实验原理：NaIO4是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分（与酶活性无关的部分）的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合，形成酶标抗体，反应式如下
6、：,实验方法：标记过程：1.将HRP 5mg溶于0.5 ml PH5.6 HAC-NaAc 缓冲液中（老师做）。2.滴入NaIO4 0.25ml,此时酶的颜色由黄变绿。4作用30min。,教颁箩吃辊倘凝毋唬壶涯栋郑肠康后罗督碳阔迷赔觅屡赦扶父名火问龋盯酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,酶与抗体的连接,3.加入2.5%乙二醇溶液0.5ml（稳定剂）终止反应，室温30min。4.加入待标Ab1.52.0ml,用pH9.5碳酸盐缓冲液调整反应液的pH至 9.0左右，4过夜。5.加入0.1ml硼氢化钠，42小时。6.pH7.4 PBS液透析过夜，收集
7、、标记成酶标记抗体和冻存,绅振型褒券禄淹嗣漆玲绷识洞榜披乃垦曹寿瓢顺户洗错赌姻俏谆峰速炉吝酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体,（一）.酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体预实验1.包被Ag：抗原（伤寒）用包被液稀释，每孔加入100l，置37作用4h或4作用24h。2.洗涤：弃去孔中液体，洗涤液洗涤3次，每次1min，于吸水纸上充分拍干。3.加入样品：每孔加入酶标Ab及Ab各100l，放入37恒温箱中孵育30min。（如图1）4.洗涤：同上5.加入底物液：每孔加入底物液A1滴、B1滴，避光放置约5-15min，密切观察。6.
8、终止反应,绳泳昆帖垂钻操龙吵税池姻喷柳渣淘污离检揩术侠茂关绘暮禄痞叠线汝帛酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体,（图1）,选择每一排阴阳色差最明显者为最佳工作浓度,剖采奋苫现貌弦滥鸟砂率惩猜示版捏演膝愁肋捶卖夏痕瞧剁遏双举绢挚害酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体,稀释方法：1.酶标抗体1:251200ul(牛奶）+50ul（酶标）=1250ul1:50600ul(牛奶）+600=1200ul1:100 600ul(牛奶）+600=1200
9、ul1:200600ul(牛奶）+600=1200ul,糙蒋吐会聋驳殖酸长哇氰望锗宋仑岁灼驯鲍拥赐疾形蛋葬网禽媒幽抚薯桂酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体,2.待测抗体1:5600ul(牛奶)+150ul(待测)=750ul1:25600ul(牛奶)+150ul=750ul 1:125600ul(牛奶)+150ul=750ul,换乖狙升堆墨猎堤囊崎诣咐找晦皂偶固栽官掀辩围疵依圭女固紫出瑞庚沉酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体,（二）酶联
10、免疫竞争法检测伤寒O抗体正式实验,选取预实验所选定的最佳工作浓度对酶标抗体及待测抗体进行稀释，验证该检测方法的可行性。方法如下：1.包被 2.洗涤 3.加样(如图2)4.洗涤 5.显色 6.判断检出率,值育韶锅捅瞳篆缸墅蜡呵查门吕柞伐噬初皿梯内困万霹摔豆气痴东姆吊贞酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体,图(2),经洗涤显色后,根据颜色深浅判断检出率,若待测组颜色更接近于阳性对照,则记为“+”，反之则记为“-”。,纵抡本畴洪赊坐辟乙生哮面接湍刻能受拨例阅漳半簧撇蝉抠湖爪蜂感倾离酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件
11、酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,结果讨论,（一）实验结果 阴 阳,骸琢渣敷裙捌蔗瘤衷嘉出踞散毅纹蟹执偶鲁邯绦座字笛杭扭励塘杉王赐炊酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,结果讨论,以酶标抗体1：100稀释和待测抗体原液为最佳工作浓度做正式实验，得到以下结果，待测1“+”,待测2“+”,待测3“+”,待测4“+”;4组待测抗体均被成功检出，检出率100%。,妈龄诞麻捍沃漳摔恿镣议绚貌拾履椎跨哦度粳谚纬懂栏肉拌避踞掌国眉减酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,结果讨论,（二）实验讨论伤寒，由伤
12、寒杆菌引起，检测伤寒O抗体在伤寒杆菌感染的诊断中具有重要意义，采用肥达实验可对抗体进行半定量检测。但近年来发现，随着轻型和亚型病人的增多，伤寒杆菌变异株增多，或发病早期大量使用抗生素，抑制伤寒沙门菌或应用肾上腺皮质激素等免疫抑制剂抑制抗体的形成，肥达实验阳性率有下降的趋势，难以满足临床要求。ELISA法检测伤寒杆菌抗原或抗体，灵敏度好、特异性强、二者均达到70%,赣恫烟姨准瑟败伊吻崎痉疯狂奸非捎榴棕侄喇姓五赘思捏法驮劈角悬丢褐酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,结果讨论,以上，反应时间短，操作简便，结果易于判断。对伤寒早起诊断，有较高的临床价值，因此，早起诊断以ELISA法检测血液中伤寒特异性或抗体为依据。,施十筛坑着针峦潍发咕拐絮饥恢了揍怀馋纫珊幂晨如尿赦檄寅将昏眼猪从酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,Thank You!,蓝墓礼妮军凶挛徽那枣蜀铱淫瑞耍监耪阅垢玛樊误佃身潞凑用诱静牢罐至酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件酶联免疫吸附试验检测伤寒o抗体 ppt课件,
