第2章蛋白质.ppt

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1、第一章 蛋白质,Protein,第一节 前 言,蛋白质Protein第一重要,蛋白质分布广泛、功能多样,1.催化功能-酶（如：淀粉酶）2.结构功能-皮、毛、骨、牙、细胞骨架3.运动功能-鞭毛、肌肉蛋白4.防御功能-免疫球蛋白5.运输功能-血红蛋白6.接受或传递信息受体蛋白7.调节功能-调节或控制细胞的生长、分化、遗传信息的表达8.贮藏功能-种子中的谷蛋白,一、蛋白质的生物学意义,没有蛋白质就没有生命。,1、元素的组成：C、H、O、N、S等 N的含量一般为16%凯氏定氮法测定蛋白质的含量：蛋白质含量=蛋白氮6.25（6.25=1/16%）2、组成单位氨基酸,二、蛋白质的组成,三聚氰胺 cyanu

2、ramide 分子式C3H6N6 蜜胺,牛胰脏RNase蛋白分子氨基酸组成,第二节 氨 基 酸,氨基酸的分类,基本氨基酸（蛋白质氨基酸）：蛋白质的组成单位，20种，稀有蛋白质氨基酸：非蛋白质氨基酸：,一、蛋白质的组成单位基本氨基酸,1.化学结构R-CH(NH2)-COOH含有氨基的羧酸R 代 表 氨 基 酸 之 间 相 异 的 部分，叫 R 基，又 称 为 侧 链。,酪氨酸分子,除脯氨酸外，其他均具有如上结构通式。,不变部分,可变部分,2.结构通式,组成蛋白质的基本氨基酸有20种，除脯氨酸为-亚氨基酸外，均为-氨基酸除甘氨酸外，都具有旋光性（+、-）和光学异构体（D或L型）除了甘氨酸外，蛋白质

3、水解后的所有-氨基酸都是L型,什么是-氨基酸？-C-C-C-C-COOH-C-C-C-C(NH2)-COOH-氨基酸-C-C-C(NH2)-C-COOH-氨基酸-C-C(NH2)-C-C-COOH-氨基酸,L-构型与D-构型互为镜像,二.基本氨基酸的结构及分类,（一）按侧链R基的极性：1、非极性氨基酸2、极性氨基酸2.1 碱性氨基酸2.2 酸性氨基酸2.3 不带电荷氨基酸,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine异亮氨酸 Ileucine脯氨酸 Proline甲硫氨酸 Methionine苯丙氨酸 Phenylalanine色氨酸 Trytoph

4、an,1.非极性氨基酸,氨基乙酸,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine异亮氨酸 Ileucine脯氨酸 Proline甲硫氨酸 Methionine苯丙氨酸 Phenylalanine色氨酸 Trytophan,1.非极性氨基酸,-氨基丙酸,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine异亮氨酸 Ileucine脯氨酸 Proline甲硫氨酸 Methionine苯丙氨酸 Phenylalanine色氨酸 Trytophan,1.非极性氨基酸,-氨基异戊酸,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanin

5、e缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine异亮氨酸 Ileucine脯氨酸 Proline甲硫氨酸 Methionine苯丙氨酸 Phenylalanine色氨酸 Trytophan,1.非极性氨基酸,-氨基异己酸,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine异亮氨酸 Ileucine脯氨酸 Proline甲硫氨酸 Methionine苯丙氨酸 Phenylalanine色氨酸 Trytophan,1.非极性氨基酸,-氨基-甲基戊酸,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine异亮氨酸 Ileucine脯

6、氨酸 Proline甲硫氨酸 Methionine苯丙氨酸 Phenylalanine色氨酸 Trytophan,1.非极性氨基酸,吡咯,-吡咯烷基-羧酸,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine异亮氨酸 Ileucine脯氨酸 Proline甲硫氨酸 Methionine苯丙氨酸 Phenylalanine色氨酸 Trytophan,1.非极性氨基酸,硫醚,-氨基-甲硫基丁酸,1.非极性氨基酸,苯基,-氨基-苯基丙酸,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine异亮氨酸 Ileucine脯氨酸 Pro

7、line甲硫氨酸 Methionine苯丙氨酸 Phenylalanine色氨酸 Trytophan,1.非极性氨基酸,吲哚,-氨基-吲哚基丙酸,甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine缬氨酸 Valine亮氨酸 Leucine异亮氨酸 Ileucine脯氨酸 Proline甲硫氨酸 Methionine苯丙氨酸 Phenylalanine色氨酸 Trytophan,难溶于水，具有很强的疏水聚合能力，脯氨酸成“结节”。R基团疏水性强，在蛋白质高级结构中成疏水键，对稳定高级结构很重要。,非极性氨基酸的特点：,精氨酸 Argini赖氨酸 Lysine组氨酸 Histidine,2.1 碱性氨

8、基酸,胍基,碱性氨基酸在pH值7.0时侧链基团带正电荷,-氨基-胍基戊酸,精氨酸 Arginine赖氨酸 Lysine组氨酸 Histidine,2.1 碱性氨基酸,碱性氨基酸在pH值7.0时侧链基团带正电荷,，-二氨基己酸,精氨酸 Arginine赖氨酸 Lysine组氨酸 Histidine,2.1 碱性氨基酸,咪唑基,组氨酸在pH值7.0时侧链基团带部分正电荷,-氨基-咪唑基丙酸,天冬氨酸 Aspartate 谷氨酸 Glutamate,2.2 酸性氨基酸,酸性氨基酸在pH值7.0时侧链基团带负电荷,-氨基丁二酸,天冬氨酸 Aspartate 谷氨酸 Glutamate,2.2 酸性氨基

9、酸,酸性氨基酸在pH值7.0时侧链基团带负电荷,-氨基戊二酸,丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine天冬酰胺 Asparagine谷氨酰胺 Glutamine半胱氨酸 Cysteine酪氨酸 Tyrosine,2.3 极性不带电荷氨基酸,羟基,比非极性氨基酸易溶于水，侧链中含有不解离的极性基。,-氨基-羟基丙酸,丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine天冬酰胺 Asparagine谷氨酰胺 Glutamine半胱氨酸 Cysteine酪氨酸 Tyrosine,2.3 极性不带电荷氨基酸,比非极性R基氨基酸易溶于水，侧链中含有不解离的极性基。,-氨基-羟基丁酸,丝氨酸 Seri

10、ne 苏氨酸 Threonine天冬酰胺 Asparagine谷氨酰胺 Glutamine半胱氨酸 Cysteine酪氨酸 Tyrosine,2.3 极性不带电荷氨基酸,酰胺,比非极性R基氨基酸易溶于水，侧链中含有不解离的极性基。,丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine天冬酰胺 Asparagine谷氨酰胺 Glutamine半胱氨酸 Cysteine酪氨酸 Tyrosine,2.3 极性不带电荷氨基酸,比非极性R基氨基酸易溶于水，侧链中含有不解离的极性基。,丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine天冬酰胺 Asparagine谷氨酰胺 Glutamine半胱氨酸 Cyste

11、ine酪氨酸 Tyrosine,2.3 极性不带电荷氨基酸,巯基,比非极性R基氨基酸易溶于水，侧链中含有不解离的极性基。,-氨基-巯基丙酸,丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine天冬酰胺 Asparagine谷氨酰胺 Glutamine半胱氨酸 Cysteine酪氨酸 Tyrosine,2.3 极性不带电荷氨基酸,比非极性R基氨基酸易溶于水，侧链中含有不解离的极性基。,-氨基-对羟苯基丙酸,（一）按R基的极性分:非极性氨基酸-Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Met,Pro,Trp.极性氨基酸 极性带正电荷的碱性氨基酸-His,Lys,Arg 极性带负电荷氨基酸酸性氨基

12、酸-Glu,Asp.极性不带电荷-Ser,Thr,Tyr,Gln,Asn,Cys.,小结,小 结,（二）按R基的化学结构分:脂肪族氨基酸Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Met,Cys,Ser,Thr；Glu,Gln,Asp,Asn,Lys,Arg.芳香族氨基酸Phe,Tyr,Trp 杂环氨基酸His。杂环亚氨基酸Pro,（三）从营养学角度分:必需氨基酸：8种。苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸 Thr、Ile；Lys、Val、Leu；Trp、Phe、Met.Ile Met Lys Val Leu Trp Phe Thr 一 家 来 写 两 三 本 书半必

13、需氨基酸：精氨酸和组氨酸（Arg、His）非必需氨基酸：10种组氨酸是婴儿和少儿的必需氨基酸。,植物能够合成所有的氨基酸，但是各种植物蛋白的氨基酸组成差异较大，因此，某种植物蛋白能完全符合人体和动物的氨基酸比例是没有的。当某种氨基酸含量低于标准水平时，不论其它必需氨基酸比例如何适当，其营养价值必然大减。这种最低量的必需氨基酸称为限制性氨基酸。如禾谷类种子的小麦、大麦、玉米、大米等，赖氨酸为第一限制氨基酸。,限制性氨基酸,三.稀有蛋白质氨基酸,在某些蛋白质中存在的少数不常见氨基酸。由相应的基本氨基酸经化学修饰而来的。,四.非蛋白质氨基酸（不是组成蛋白质的氨基酸）,广泛存在于各种细胞和组织中，以游

14、离状态或结合状态存在，不参与蛋白质的组成，种类已超过250种。大都是氨基酸的衍生物，有些是、或氨基酸，有些是D型氨基酸，例如鸟氨酸、胍氨酸、丙氨酸、D谷氨酸等。目前认为有些非蛋白质氨基酸是某些代谢过程的中间产物或重要代谢物的前体。如：瓜氨酸和鸟氨酸精氨酸 刀豆氨酸和5羟基色氨酸杀虫杀菌。茶氨酸品质。多巴胺神经递质绝大部分非蛋白氨基酸的功能不清楚。,五.氨基酸的理化性质,(1)无色晶体，高熔点;(2)在水中溶解度差异很大，溶于稀酸或稀碱，不溶于有机溶剂；,1、一般物理性质,2、两性解离与等电点,氨基酸是两性电解质，在结晶形态或在水溶液中主要以两性离子状态存在。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH

15、3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。,氨基酸在水溶液中的离子化程度与pH 值有关，pH值低时以阳离子状态存在？，pH值高时以阴离子状态存在？。,阳（正）离子 两性离子 阴（负）离子 pHpI,氨基酸的等电点pI：,当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸的氨基和羧基的解离度完全相等，即正离子=负离子，净电荷为零，在电场中既不向阳极移动，也不向阴极移动，成为两性离子(也称兼性离子)。,氨基酸的等电点pI：氨基酸净电荷为零时所处溶液的pH值。pI（Isoelectric point),Aa Aa Aa,在PI时,整理得：H+2K1K2,据质量作用定律：,等 电 点 的 推 导,-H+2=-

16、K1-K2 PH=PI=(PK1+PK2)/2,侧链不含解离基团的中性氨基酸，其等电点是两性离子状态两侧pK1和pK2的算术平均值：pI=(pK1+pK2)/2 丙氨酸（一氨基一羧基）:pK1=2.34,pK2=9.69 pI=(pK1+pK2)/2=6.02 Ala Ala Ala,氨基酸的等电点的计算,对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR-COOH)/2 天冬氨酸（二羧基一氨基）Asp Asp Asp Asp碱性氨基酸：pI=(pK2+pKR-NH2)/2 赖氨酸（一羧基二氨基）,pK3,pK3,H+,H+,p

17、K2,pK2,pK1,pK1,H+,H+,H+,H+,Lys Lys Lys Lys,中性氨基酸pI一般为6.0提问：为什么偏酸性？,提 问：大 多 数 氨 基 酸 在 中 性（pH=7）时，带 电？,答：COOH解离程度略大于-NH2的得电子能力,提问：酸性氨基酸的pI(更偏酸、更偏碱）？,更酸（3.0 左 右）,碱 性 氨 基 酸pI 更 碱（7.610.7),提问：碱性性氨基酸的pI(更偏酸、更偏碱）？,负,等 电 点 的应用 溶 解 度 最 小，易 于 沉 淀，利用这一性质可以分离制备某些氨基酸。,除甘氨酸外，氨基酸均含有一个不对称-碳原子，因此有L-和D-型两种光学异构体。自然界的氨

18、基酸主要以L-型存在。,3.氨基酸的光学性质,3.1旋光性和光学异构体,3.2 氨基酸的光吸收,20种基本氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)，R基团含有苯环的共轭双键的酪氨酸（Tyr、278nm）、苯丙氨酸(Phe、259)和色氨酸(Trp、279)有光吸收。,4、氨基酸的化学反应,氨基酸的化学反应主要是指它的氨基和羧基以及侧链上的功能基团所参与的那些反应，因此可以发生的反应很多。,(1)与茚三酮反应,-氨基和羧基共同参与的反应,紫色复合物,脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质（因其为亚氨基酸，反应不释放NH3）,所有游离氨

19、基酸与茚三酮作用都生成蓝紫色物质;,N+,黄色化合物,应用：氨基酸的定性、定量分析（比色法、显色剂、气体分析法）。,（2)Sanger(桑格）反应,与2，4二硝基氟苯（DNFB）反应,应用：分析多肽链或蛋白质的N端氨基酸。,（有机相）,黄色,（水相）,游离,1953,英国著名化学家Sanger大量使用该反应测定了牛胰岛素的一级结构(51个氨基酸),所以该反应也称Sanger反应。近年来测定N端氨基酸，广泛使用5二甲氨基萘磺酰氯。反应生成物5二甲氨基萘磺酰氨基酸有强烈的荧光。可用荧光光度计快速测定出来。而且灵敏度极高。,与丹磺酰氯（DNS-Cl）的反应：生成荧光物质DNS-氨基酸,游离,（3）E

20、dman（艾德曼）反应(1950年),与异硫氰酸苯酯（PITC）反应,应用：分析多肽链或蛋白质的N端氨基酸。,PTC-多肽,PTH氨基酸,弱碱性,无水酸,无水酸,在弱碱性条件下，氨基酸中的氨基 与PITC反应，生成相应的PTC氨基酸，在无水酸中，PTC氨基酸环化成PTH 氨基酸；应用：鉴定多肽或蛋白质N端的氨基酸。,重复使用该法，可测定多肽或蛋白质的氨基 酸顺序，据此原理,人们设计出“多肽顺序自 动分析仪”，对氨基酸顺序进行自动分析。,5、氨基酸的分析分离,电泳法层析法（包括柱层析、纸层析、薄层层析）（分配层析、亲和层析、离子交换层析）,第三节、肽（peptide),一个氨基酸的羧基和另一氨基

21、酸的氨基脱水后形成的化合物叫做肽。,肽键(酰胺键),1.成 肽 反 应,多个氨基酸形成的肽叫多肽，呈链状故又称多肽链。,2、肽键(peptide bond),氨基酸之间脱水后形成的键为肽键，也为酰胺键,4、N端、C端、肽的命名、肽链写法：开链肽带自由氨基的一端为N端(H表示),带自由羧基的一端为C端(用OH表示)。肽的命名：参与组成肽的氨基酸残基命名，通常从肽链的N端开始，称为某氨酰某氨酰某氨酸。肽链写法：游离-氨基在左，游离-羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。如：HGluCysGlyOH,谷氨酰半胱氨酰甘氨酸,氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。上

22、述五肽可表示为：,丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸（SerGlyTyrAlaLeu）,5、肽的性质,两性解离及等电点-羧基的pK值比游离氨基酸的大些-氨基的pK值比游离氨基酸的小些侧链基团的pKR变化不大化学反应茚三酮反应、Sanger反应、Edman反应、双缩脲反应（两个以上肽键,紫红色到蓝紫色络合物）,双缩脲反应 双缩脲在碱性溶液中与CuSO4作用产生紫红色络合物的反应称双缩脲反应。肽分子中含有许多类似双缩脲结构的肽键,所以也能发生双缩脲反应。,6、活性肽蛋白质=1或几条长多肽链+或不+辅助基团 短链且具有生物功能的多肽通常称为活性肽。活性肽不算蛋白质！如：谷胱甘肽；激素类多肽；脑啡肽；抗生

23、素类多肽；蛇毒多肽等。,牛催产素,牛升压素,2种脑啡肽,第四节、蛋白质的结构,蛋白质是由一条或多条多肽链以特殊方式组合成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿(dalton,d)以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到100万道尔顿甚至更大。,四级结构不总是有的,蛋白质有四种结构层次,一.蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构(primary structure)指多肽链内氨基酸残基从N-末端到C-末端的排列顺序，或称氨基酸序列。,P40,蛋白质的化学结构的内容包括:多肽链的数目多肽链的氨基酸顺序多肽链内或链间二硫键的数目和位置。二硫键：由

24、肽链中相应部位上两个半胱氨酸残基脱氢连接而成的,二 硫 键,提问：维持蛋白质一级结构的作用力是?键。,答 案：肽 键、二硫键（都属于共价键）,链间二硫键,链内二硫键,1965年我国在世界上第一个用化学方法人工合成的蛋白质就是这种牛胰岛素。,牛胰核糖核酸酶的一级结构,1960,（1）分离纯化蛋白质（用电泳、层析或超 滤的方法，纯度要大于97%以上）；（2）测定氨基酸组成（3）肽链末端氨基酸的测定（4）专一性部分裂解（两种以上方法）；（5）肽片段的分离纯化（6）各个肽段的氨基酸序列测定（7）确定整个肽链的氨基酸序列,蛋白质一级结构测定的步骤,P41,（5）分析多肽链的N-末端和C-末端;,N-端氨

25、基酸分析法（最重要）：DNFB法、Edman法、氨肽酶法（肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解）,C-端氨基酸分析法：羧肽酶法（肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的向里水解）、肼解法,肼解法,多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物；肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,二、蛋白质的构象和维持构象的作用力,1、构型和构象构型（configuration）：立体异构体分子中取代原子或基团在空间的取向。构型互变需要共价键的断裂。构象（conformation）：取代基团单键旋转时形成的不同立体结构。构象的改变不涉及共价键

26、的断裂,2、维持蛋白质构象的作用力,氢键范德华力疏水作用盐键二硫键配位键,范德华力（分子间作用力，受彼此距离影响）,疏水键 非极性基团被极性水分子排挤相互聚拢的作用力。,氢键：侧链间形成,离子键（盐键）,二、蛋白质的二级结构,P44,定义：,肽链主链不同肽段通过自身的相互作用、形成氢键、沿某一主轴盘绕折叠而形成的局部空间结构。,二级结构的类型：-螺旋、-折叠、-转角和无规则卷曲,一个具有生物活性的多肽链在一定条件下往往只有一种或几种构象，主要是因为肽链结构的高度共振稳定性。,1、多肽链折叠的空间限制,P44,多肽链通过可旋转的-碳原子连接的酰胺平面链,P44-45,肽键(CONH)带有部分双键

27、的性质,使主链上1/3的键不能旋转（链上1/3是CN键）；非键合原子之间的最小接触距离；R侧链的影响，其影响程度与R侧链基团的性质（大小、亲水性、电荷相吸和排斥）有关。,多肽链折叠的空间限制因素：,肽键平面由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元。,P44,C-N:0.147nmC=N:0.127nm肽键C-N：0.132nm,2、-螺旋(-helix)最常见,是肽链主链的盘绕形式有左右手之分，天然蛋白质的-螺旋通常为右手-螺旋每圈含3.6个Aa残基，螺距为0.54nm；Aa残基侧链伸向外侧，螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与中心

28、轴平行；,螺旋结构要点,P45,1950，Pauling提出,氢键是一个氨基酸残基的-NH基与前面隔3个氨基酸残基的的-C=O基形成。,不利于-螺旋稳定的因素：,当Pro存在时，螺旋中断，产生一个“结节”；带相同电荷的氨基酸连续出现的区域由于同种电荷的互斥效应不利于-螺旋的形成；,R基团太大，造成空间阻碍作用。,P46,2、折叠(pleated sheet),相邻肽链走向平行或反平行，反平行更稳定肽链按层排列，主链呈锯齿状；相邻肽链主链上的N-H和C=O之间形成氢键；R侧链交替地分布在片层的上下方。,2条或几条肽链（1条肽链的若干肽段）侧向聚集，通过相邻肽链主链上的N-H与C=O之间有规则的氢

29、键，形成的扇面状片层结构。,P46-47,平行式,反平行式,-折叠包括平行式和反平行式两种类型,折叠中的氢键与-螺旋中的氢键有何不同？,答案：在相邻两条肽链间或同一条肽链不同肽段间主链上的N-H和C=O之间形成。,3、转角（turn）,作用力氢键残基n的CO键与残基n3的NH基间形成氢键转角中只有1个氢键,P48,主链上180的回折结构，由四个连续的Aa残基组成;回折处的第一个Aa残基的-C=O 和第四个Aa残基的 N-H 之间形成氢键；,转角的结构要点：,P48,4、无规卷曲（nonregular coil）或自由回转（random coil),没有确定规律的松散的肽链结构。有利于多肽链形成

30、灵活的、具有特异生物活性的球状构象。通常酶的活性中心常处在无规卷曲构象区域里。作用力弱,P49,维持蛋白质二级结构的作用力是？,答：氢键,三.蛋白质的超二级结构和结构域,超二级结构(supersecondary structure)：,超二级结构在结构的组织层次上高于二级结构，可充当三级结构的构件，但没有形成完整的结构域。已知的超二级结构有，等。,是指多肽链上若干相邻的构象单元彼此作用，形成有规则的，在空间上能辨认的结构组合体。,P51,结构域（structural domain）：,单结构域蛋白质结构域三级结构 多结构域蛋白质结构域 三级结构,在二级结构或超二级结构的基础上形成并相对独立的三

31、级结构局部折叠区，是在空间上能辨认的三维实体。可充当三级结构的组件,P51,结构域的组织层次介于超二级结构和三级结构之间。,丙酮酸激酶,己糖激酶,前清蛋白,肌红蛋白,免疫球蛋白,四、三级结构（Tertiary Structure）,维系三级结构的作用力主要有氢键、疏水作用、离子键、范德华力和二硫键等。,P49,定义：多肽链在二级结构、超二级结构或结构域的基础上通过侧链基团的相互作用进一步盘绕、折叠形成的紧密的借各种次级键维持的球状分子构象。,CH2OH,CH2OH,维持三级结构的作用力,肌红蛋白的三级结构,P50,五、四级结构（Quaternary Structure）,亚基(subunit)

32、：每个具有独立三级结构的多肽链。亚基虽有三级结构，但单独存在没有生物活性或活性低。亚基一般只有一条多肽链，但有的亚基由两条或多条肽链组成，其间通过二硫键相连。亚基可以相同/不相同。,P51-52,1、定义：由相同或不同亚基按照一定排布方式通过次级键聚合而成的蛋白质结构。,单体蛋白质（整个分子只有一条肽链组成）的最高级结构为三级结构。只有寡聚蛋白才具有四级结构。寡聚蛋白中的每个亚基若单独存在，纵使具有三级结构也无生物活性，只有整个分子具有完整的四级结构才有生物活性。,血红蛋白,2、四级结构的内容,亚基的数目4条 种类2种亚基的立体分布球形亚基的相互作用次级键,亚基单独没有生物功能四亚基两两相同，

33、分别称为1、2、1、2；每个亚基都以非共价键与一个血红素辅基相连,氨基酸序列大不相同，但三 级结构相似，功能也相似（载氧）结构决定功能,肌红蛋白,血红蛋白,多肽链的主链首先折叠成一系列的二级结构构象单元，相邻的构象单元随机组合成规则的超二级结构，若干超二级结构进一步盘旋产生结构域，两个或多个结构域形成具有独立三级结构的单体或亚基，最后，若干亚基组装成具有特定四级结构的寡聚体。,三、维持蛋白质结构的作用力,一级结构：肽键、二硫键（都属于共价键）二级结构：氢键（主链上C=O和NH之 间形成）三、四级结构：二硫键、次级键（氢键、疏 水键、离子键、范德华力）,键 能肽键 二硫键离子键 氢键疏水键 范德

34、华力,1、同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化,一、蛋白质的一级结构与功能的关系,第五节 蛋白质分子结构与功能关系（研究热点）,P52-59,同源蛋白质:不同有机体中实现同一功能的蛋白质。例如：细胞色素C,黑猩猩 0 鸡、火鸡 13牛猪羊 10 海龟 15狗驴 11 小麦 35粗糙链孢霉 43 酵母 44,亲缘关系越近，AA顺序的同源性越大不同生物间存在相同的保守顺序,分子病：由于基因突变导致蛋白质一级结构发生变异，使蛋白质的生物学功能减退或丧失，甚至造成生理功能的变化而引起的疾病。,2、一级结构的变化引起功能的变化,例如：血红蛋白一级结构的变化引起镰刀型贫血病,镰刀状贫血病血液中大量出现镰

35、刀型红细胞，患者因缺氧窒息；它是最早认识的一种分子病。流行于非洲，死亡率极高，大部分患者童年时就夭折,活过童年的寿命也不长，它是由于遗传基因突变导致血红蛋白分子结构的突变。,正常型链-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys-HbA 谷氨酸 镰刀型链-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys-HbS 缬氨酸,谷A（极性）缬A（非极性）,显著降低HbS溶解度 纤维状沉淀 细胞由球状变为镰刀形 易破裂，堵塞 O2供应不足 患者窒息甚至死亡,二、空间结构与功能的关系,1、蛋白质执行其生物功能需要相应的空间结构,例1：核糖核酸酶,功能恢复,功能丧失,天然构象 无规线团,8N

36、尿素、巯基乙醇,肌红蛋白(153aa)血红蛋白(141aa)血红蛋白(146aa)结构相似 功能相似（载氧）结构决定功能,例2：血红蛋白和肌红蛋白的结构与功能,2、变构效应allosteric effect,定义：蛋白质在表达功能的过程中构象发生 变化的现象,外因通过改变蛋白质构象引起蛋白质功能变化的现象。蛋白质构象并不是固定不变的，有些蛋白质表现其生物功能时，构象发生改变，从而改变了整个分子的性质，这种现象称为别构现象。别构蛋白各部位之间的影响是通过构象变化传递的，这种构象变化可以从一个亚基传到另一个亚基，引起协同的相互作用。例如：血红蛋白的载氧气过程,(R)relaxed state,(T

37、)tense state,血中氧分子的运送：,静脉,动脉,环境O2高时Hb快速吸收O2,环境O2低时Hb 迅速释放O2,释放O2后Hb 变回T state,1、蛋白质带电性的原因（酸、碱性）肽链末端的-NH3+、-COO侧链上可解离的基团，如-氨基、/-羧基、咪唑基、胍基、酚基、巯基等：,pI通常在6.0左右,一、蛋白质的两性电离及等电点,P58,第六节 蛋白质的性质,2、等电点,定义：蛋白质颗粒所带净电荷为零时所处溶液的pH即为该蛋白质的等电点pI 等电点不是蛋白质的特征常数，,P59,影响因素：所含氨基酸的种类和数量（有关）pI受介质中离子强度的影响,特征：pI时，蛋白质的溶解度、粘度、渗

38、透压、导电能力及膨胀性最小。,蛋白质的等离子点：在不含盐的纯水中测定的蛋白质的等电点。等离子点才是蛋白质的特征常数,59,应用：等电点沉淀（分离提纯蛋白质）溶解度最小 电泳（分离鉴定蛋白质）带电性质的应用,提问：如何根据等电点来分离混合液中的不同蛋白质？,P58,调整溶液pH，使不同等电点的蛋白质在各自等电点 pI处依次沉淀下来。,带电的颗粒或大分子如蛋白质在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳,P59,1、透析：,提取蛋白质和酶时广泛采用,2、亲水胶体：,大多数球状蛋白溶于水，能形成稳定的胶体溶液。,蛋白质胶体溶液稳定的原因？蛋白质颗粒在非等电点时带有同种电荷，相斥蛋白质颗

39、粒表面带有很多极性基团，形成水膜。,P59-60,二.蛋白质的胶体性质,分子量大，可形成胶体溶液:布朗运动,丁达尔现象,电泳,不能透过半透膜,并具有吸附能力。,三、蛋白质的分子量（1道尔顿1.6610-27千克）常用的测定方法有：沉降分析法(沉降速度法，沉降平衡法）凝胶过滤法（分子筛层析法）SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳法。,P60-62,沉降系数:单位离心场沉降分子下沉的速度.1S=110-13秒。血红蛋白沉降系数4.4610-13秒4.46S,1.沉降速度法(超速离心法）,注意：S越大的分子其分子量就越大：40S 20S沉降系数S与分子量没有正比关系。沉降系数相加没有意义：两个亚基单独测定分别为

40、20S、60S，但聚合体测定并不等于80S，20S+60S80S,2.凝胶过滤法（Gel Filtration）,凝胶法过滤只适于球状蛋白分子测量,LogM=k1-k2Ve,蛋白质的洗脱体积与其分子量有关：,（Ve为洗脱体积）,测得几种标准蛋白质的Ve；以分子量对数对Ve作标准曲线；测出待测样品的Ve；查标准曲线确定其分子量。,3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS Polyacryamide Gel Electrophoresis，PAGE）,常规PAGE净电荷，分子量，形状。SDSPAGE:迁移率主要取决于分子量，而电荷和分子形状无关。可以估算出不同蛋白质的分子量。,四.蛋白质的沉淀反应,

41、破坏蛋白质的水膜中和蛋白质的电荷,P62-63,高浓度的中性盐、有机溶剂、重金属盐、生物碱等试剂可破坏蛋白质胶体稳定条件，而产生沉淀。,蛋白质沉淀。,蛋白质溶液的稳定性：电荷、水膜,加入大量中性盐若在蛋白质溶液中加入少量的中性盐，则蛋白质的溶解度会增加，这种现象叫盐溶。,分子在其pI时，容易互相吸引，聚合沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。,蛋白质的沉淀反应,若在蛋白质溶液中加入大量的中性盐，使蛋白质沉淀析出的现象叫盐析。（用于分离纯化蛋白质）,蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，当盐浓度高时，这些水分子被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，形成沉淀。,（NH4）2S

42、O4）,加入有机溶剂,向蛋白质溶液中加入有机溶剂（如甲醇、乙醇、丙酮）会使蛋白质沉淀，为什么？,有机溶剂与水的亲和力大于蛋白质，破坏了蛋白质周围的水膜；有机溶剂的介电常数比水小，导致溶液的极性减小，增加了蛋白质之间的静电吸引力，从而聚集沉淀。,加入重金属盐 pHpI时，加入HgCl2、AgNO3、Pb(Ac)2、FeCl3加入生物碱试剂或某些酸类 pHpI时，蛋白质带正电荷，易于生物碱试剂和酸类的酸根负离子发生反应等电点沉淀：中和电荷热变性使蛋白质沉淀,总之，破坏了蛋白质胶体的稳定条件之一破坏水膜或中和电荷，就可使蛋白质沉淀析出,温和结构和性质没有发生变化-非变性沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方

43、法,可逆沉淀,强烈条件沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化-变性沉淀。加热、强酸碱、重金属盐（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）、生物碱。,不可逆沉淀,五、蛋白质的变性与复性,1、蛋白质的变性：天然蛋白质因受到某些物理和化学因素的影响，使蛋白质分子原有的高级结构受到破坏，从而引起蛋白质理化性质和生物学功能的改变或丧失，但未导致一级结构变化。,天然构象（有活性）无规线团（无活性）,理化因素,P63-64,物理因素加热（70100）、剧烈振荡或搅拌 例如：卤水（少量MgCl2）豆腐、煎炒烹炸紫外线、X射线、超声波 例如：皮肤粗糙、白内障、杀菌化学因素强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、甲醛、重金属

44、盐、三氯醋酸、磷钨酸、苦味酸、浓乙醇 例如 胃酸、烈酒,2、蛋白质变性的因素有：,生物活性丧失（最主要）:如酶失活理化性质改变 溶解度下降，易沉淀 结晶能力丧失 渗透压力、扩散速度降低 粘度、旋光性负值上升，等电点上升 生化性质改变肽链松散、反应基团增加、易被蛋白酶水解。,3、变性蛋白的特征：,维持蛋白质高级结构的次级键和二硫键被破坏；蛋白质分子从有序卷曲结构变为无序松散结构；一级结构完好，分子量和分子组成不变。,4、蛋白质变性的本质：,5、变性的预防和利用：临床急救农药中毒消毒：75%乙醇食品制作：豆腐酶制剂的制备,大纤维,皮层细胞,鳞状细胞,微纤维,微纤维,原纤维,螺旋,卷发(烫发)的原理

45、,永久性卷发（烫发）是一项生物化学工程，-角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为-构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。,定义：变性蛋白质去除变性因素后，恢复原来的空间结构和生物活性的现象。本质：一级结构决定高级结构,核糖核酸酶A,6、复性(renaturation),理论上可以，但很难使外界因素完全复原。,提问：是否所有的蛋白质变性都是可逆的？为什么？,六、蛋白质的光学性质紫外吸收特性,大部分蛋白质均含有带芳香环的Phe、Tyr、Trp(共轭双键体系)，因此大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。,七.蛋白质的颜色反应,双缩脲反应（肽键）黄色反应：黄色

46、橘黄色，鉴定Phe、Tyr、Trp 米伦氏反应：红色沉淀，鉴定Tyr茚三酮反应：蓝紫色反应(定性定量分析）乙醛酸反应：紫色环，鉴定含Trp的反应；坂口反应：红色产物，鉴定Arg的反应；酚试剂反应：蓝色，鉴定Trp,按分子形状：球状蛋白质和纤维状蛋白质按分子组成：简单蛋白质：完全由多肽链组成结合蛋白质：由简单蛋白质和非蛋白质成分组成按结构：单体蛋白和寡聚蛋白质,八.蛋白质的分类,九、蛋白质含量的测定,定氮法：灵敏度较低双缩脲法：样品量0.2-1.7mg/mlFolin法：灵敏度较高25g-250g/ml.紫外吸收法：蛋白质浓度1.45A280-0.74A260考马斯亮蓝法（Bradford法）,

47、九、分离提纯蛋白质的主要方法,1.凝胶过滤法（同前）2.电泳法（同前）3.亲和层析法：是利用蛋白质分子的亲和力。操作步骤为：在一定pH和离子强度下，让样品与亲和吸附剂或配体充分接触，待分离的组分完全吸附在亲和吸附剂上后，用适当洗脱剂将欲分离的组分从亲和吸附剂上解吸下来。此法分离快，所得产品纯度高，是其优点。,掌握20种氨基酸的名称、三字符号掌握氨基酸的性质：吸收光谱，等电点，三个反应（原理及其应用）。掌握蛋白质一，二，三，四级结构，超二级结构，结构域的有关概念，-螺旋，-折叠的要点。掌握维系蛋白质结构的作用力，了解结构与功能的关系。掌握蛋白质的酸碱性质，吸收光谱，胶体性质和沉淀反应，变性（概念，机理，特征，条件）。掌握蛋白质N末端C末端氨基酸测定的方法熟悉氨基酸和蛋白质分离主要方法的原理,学习要点,