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1、第十三章 DNA的复制和修复,1958年，F.Crick提出中心法则,揭示了生物体内遗传信息的传递方向：（1）以原DNA分子为模板，合成出相同DNA分子的过程。（2）以某一段DNA分子为模板，合成出与其序列对应的RNA分子的过程。（3）以mRNA为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。,DNA生物合成：DNA复制和反转录DNA的体外复制：分子克隆（PCR）。,第一节 DNA的复制一、DNA半保留复制机制1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时就推测DNA可能按照半保留机制进行自我复制。P321 图191 Watson和Crick提出的DNA双螺旋复制模型1958
2、年，Meselson和Stahl用15N标记E.coli.DNA，用密度梯度离心试验证明了DNA的复制是半保留复制。P322 图19-2 DNA的半保留复制。,1963年，Cairns用放射自显影法，在显微镜下首次观察到完整的正在复制的E.coli.染色体DNA。P323 图 19-3,二、复制起点、单位和方向DNA的复制是在起始阶段进行控制的。1、复制起点复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上（如D环复制）。多数生物的复制起点，都是DNA呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含A.T。,环状DNA复制起点的gene map
3、ping P325 图19-6,复制起点的克隆和功能分析重组质粒转化法大肠杆菌的复制起点oriC区1Kb的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样，受到严密控制，每个细胞只有1-2个拷贝，用核酸外切酶缩短oriC克隆片段的大小，最后得到245bp的基本功能区，携带它的质粒依然能够自我复制，拷贝数可以增加到20以上，这说明发动复制的序列在245bp的基本功能区，而决定拷贝数的序列在基本功能区之外和1Kb之间。鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段296bp的DNA片段上，与大肠杆菌的复制起始区有86%同源性，而且有些亲缘关系较远的细菌，其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此，复制起始区的结构可能是很保守
4、的。起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。,2、复制单位复制子(Replicon)：Genome能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是都是环状双链分子，都是单复制子。真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有100-200Kbp。病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。,3、复制方向复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。,用放射自显影实验判断DNA的复制方向及速度P325 图19-17 单向和
5、双向复制的放射自显影证明a.单向b.双向等速c.双向异速,4、DNA的几种复制方式（1）、直线双向复制单点，T7多点，真核染色体DNA（2）、型复制：环状双链DNA，单向或双向（E.coli.）（3）、滚环复制：环状单链DNA，x174（4）、D环复制：线粒体、叶绿体DNA不对称复制，两条链的复制起点不在同一点上，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代：当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制。,（5）、多复制叉复制：第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。DNA复制时复制叉前进的速率比较恒定，DNA复制的速率实际上取决于起始频率。E.coli复制叉移动的
6、速率约50Kb/min，复制一代约需40分钟4.2X106/（50KbX2）=42。富营养时，可采取多复制叉复制方式，20min复制一代。真核复制叉前进的速率约1000-3000bp/min，采用多复制子方式，真核染色体复制一代要6-8小时。,三、与DNA复制有关的酶及蛋白质因子（一）DNA聚合酶和DNA的聚合反应1、DNA聚合反应必备的条件 DNA聚合酶 DNA模板(反转录时用RNA模板)引物(DNA、RNA)4种dNTP Mg2+,2、聚合反应过程及特点总反应式：P329 图19-10 P330图19-11,DNA聚合酶的反应特点：以4种dNTP为底物 反应需要接受模板的指导，不能催化游离
7、的dNTP的聚合。反应需有引物3，-羟基存在 链生长方向5，3，产物DNA的性质与模板相同,DNA生物合成53，化学合成35,3、由DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型 P331图19-12（1）发荚环结构：加入单链DNA作为模板和引物，3羟基端回折成引物链。（2）末端延伸聚合：加入双链DNA作为模板和引物，3末端突出作为模板。（3）分枝型和切口平移型聚合：加入双链DNA，聚合发生在切口或末端单链区。（4）环形聚合：加入带引物的环形DNA作为模板。,4、E.coli DNA聚合酶（1）、E.coli.DNA pol.I（Kornberg酶，400 copy/cell）单体酶，催化活性：5，3，
8、聚合活性3，5，外切活性5，3，外切活性用蛋白水解酶将DNA pol.部分水解可得：大片段（Klenow）：5，3，聚合活性、3，5，外切活性。小片段，36Kd，活性：5，3，外切活性（只作用于双链DNA的碱基配对部分，切除修复）。Klenow片段的用途：a 补齐DNA 3，隐缩未端b.标记DNA片段未端ccDNA合成第二链 dd DNA测序,（2）、E.coli.DNA Pol.（100 copy/cell）单体酶，催化活性：5，3，聚合(活性很低)3，5，外切可能在DNA的修复中起某中作用。（3）、E.coli.DNA pol.（复制酶，10-20 copy/cell）寡聚酶。P334表1
9、0-3DNA pol.是合成新链DNA主要的酶，又称复制酶(Replicase),P334 表19-2 E.coli三种DNA聚合酶的性质比较DNA聚合酶III有6个结合位点 模板DNA结合位点 引物结合位点 引物3，-OH位点、反应位点 底物dNTP结合位点 5，3，外切位点 3，5，外切位点(校正),5、真核生物DNA聚合酶P334 表19-4 真核生物DNA聚合酶 DNA聚合酶：多亚基，是真核DNA的复制酶。DNA聚合酶：主要在DNA损伤的修复中起作用。DNA聚合酶：从线粒体得到，可能与线粒体DNA的复制有关。DNA聚合酶，特点：有3，5，外切活力,（二）引物酶或RNA聚合酶（引发酶）可
10、合成6-10个碱基的RNA引物。DNA复制为什么要用引物？（为什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？）P338从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的5，3，校对功能难发挥作用。,（三）、解螺旋酶大肠杆菌的解螺旋酶、与rep蛋白共同作用，将DNA两条链解开。解螺旋酶I、II、III沿着模板链的53方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿35方向移动。,（四）DNA旋转酶属DNA拓扑异构酶，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接，
11、反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。拓扑异构酶使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。,（五）单链DNA结合蛋白（SSB）复制叉上的解螺旋酶，沿双链DNA前进，产生单链区，大量的单链DNA结合蛋白与单链区结合，阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。,（六）DNA连接酶（ligase）连接双链DNA上的切口。大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNA缺口。T4DNA ligase即可连接粘性末端的DNA，又可连接平齐末端的双链DNA。（七）DNA复制的拓扑结构P338-339,四、DNA的半不连续复制方式P3
12、36 图19-15 DNA的半不连续复制前导链：滞后链：1968年，发现冈崎片段。长度：细菌：1Kb-2Kb，相当于一个顺反子的大小。真核：100-200bp，约等于一个核小体DNA的长度。,五、DNA复制过程（E.coli.）P342 图19-17 大肠杆菌的复制体结构示意图,1、复制的起始引发：DNA的双螺旋解开合成RNA引物的过程。引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子（dnaB、dnaC、n、nnI）构成的复合体，负责RNA引物的合成。引发体沿着模板链35方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。,大肠杆菌复制原点起始复制所
13、需蛋白质：DNaA 在原点处打开双螺旋DNaB 使DNA解旋DNaC DNaB结合在原点所需Hu 刺激起始引物酶（DNaG）合成RNA引物SSB 结合单链DNARNA聚合酶 促进DNaA活性旋转酶 松驰DNA扭曲应力,2、DNA链的延长反应链的延长反应由DNA pol.催化。复制体：在DNA合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制，称为复制体。复制体沿着复制叉方向前进就合成DNA。,3、RNA引物的切除及缺口补齐DNA pol的5，3，外切活力，切除RNA引物。DNApol的5，3，合成活性补齐缺口。4、DN
14、A切口的连接DNA ligase。5、DNA合成的终止环状DNA、线性DNA，复制叉相遇即终止。,小结：DNA解螺旋酶解开双链DNA。SSB结合于DNA单链。DNA旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物。DNA pol.在两条新生链上合成DNA。DNA pol切除RNA引物，并补上DNA。DNA ligase连接一个冈崎片段。DNA复制过程中，聚合酶对dTTP和dUTP的分辨能力高,有少量dUTP掺入DNA链中，此时，U-糖苷酶、AP内切酶、DNA pol、DNA ligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正确的碱基。,六、真核生物DNA的复制
15、 P3431、复制起点和单位真核生物染色体DNA是多复制子，有多个复制起点，可以多点起始，分段进行复制。每个复制子大多在100-200bp之间，比细菌染色体DNA（单复制子）小得多。试验证据：5-氟脱氧胞苷标记,真核生物DNA复制叉移动的速度此原核的慢。原核生物快速生长时，采用多复制叉复制。真核生物快速生长时，采用多起点复制。,2、真核复制过程中组蛋白的装配真核复制过程中DNA的复制是半保留的，而组蛋白则是全保留的。组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNA的前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。试验证据：环己酮亚胺抑制组蛋白合成，电子显微镜下观察,3、真核生物DNA复制的终止端粒（
16、telomeres）：是真核细胞染色体末端所特有的结构，一段DNA序列与蛋白质形成的一种复合体，。功能：保证线性DNA的完整复制保护染色体末端决定细胞寿命，胚系细胞含端粒酶，体细胞不表达端粒酶。,端粒末端的重复序列，通过端粒酶（telomerase）将其加到染色体末端。端粒酶含有RNA和蛋白质（起DNA聚合酶的作用）两种组分，RNA分子约159b，含有多个CyAx重复序列，RNA分子用作端粒TxGy链合成的模板。端粒酶是一种反转录酶，它只合成与酶自身的RNA模板互补的DNA片段。,七、DNA复制的调控八、DNA复制的真实性,1、DNA聚合酶对碱基的选择作用酶的被动论：正确的dNTP在聚合位点停
17、留时间长而参与聚合。DNA聚合酶能依照模板的核苷酸，选择正确的dNTP掺入引物末端。酶积极参与理论：DNA聚合酶对正确与错误的核苷酸，不仅亲和性不同，而且将它们插入DNA引物端的速度也不同。动力学校正阅读：在新的磷酸二酯键未形成时，dNTP结合在酶与模板引物复合物的聚合位点上，DNA聚合酶能识别正确与错误的dNTP。DNA聚合酶对底物的识别作用：DNA聚合酶有两种底物，一种是DNA模板引物，另一种是dNTP。DNA聚合酶先识别DNA模板和引物的3，未端，再识别底物dNTP，是一种有序的识别过程。,2、3，5，外切活性的校正阅读E.coli.DNA pol.和pol.有3，5，外切活性，可删除错
18、误插入的核苷酸。缺失3，5，外切活性的E.coli.DNA pol.，催化DNA合成时，出现错误的几率增高5-50倍。因此，3，5，外切活性可以使DNA复制的真实性，提高1-2个数量级。图,3、影响DNA合成真实性的因素 高浓度NMP(如3，-AMP,5，-GMP)NMP竞争酶的dNTP结合位点，抑制3，5，外切活性。某一种dNTP浓度银高,可使引物3，末端离开外切活性中心。dNTP 一般与二价阳离子结合成活化形式，Mg2+为主要的二价阳离子。当用其它二价阳离子（如Mn2+）代替Mg2+时，会改变酶的主体结构，影响聚合活性和3，3，外切活性。,第二节 DNA的损伤及修复紫外线可使DNA分子中同
19、一条链上两个相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体（TT），两个T以共价键形成环丁烷结构。P346图19-22目前已知有4种酶修复系统：光复活、切除修复、重组修复、SOS反应诱导的修复，后三种不需要光，又称为暗修复。,一、光复活1949年已发现细菌光复活现象，可见光（最有效400nm）可激活光复活酶，此酶能分解由于紫外线形成的嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有此酶。P347 图19-23 紫外线损伤的光复活过程,A 形成嘧啶二聚体 B.光复合酶结合于损伤部位 C 酶被可见光激活 D.修复后释放酶,二、切除修复P348 图19-24 DNA损伤的切除修复过程在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，
20、并以完整的那一条链为模板，合成出切去部分，DNA恢复正常结构。I、结构缺陷的修复：（1）核酸内切酶识别DNA损伤部位，在其附近将其切开。（2）核酸外切酶切除损伤的DNA。（3）DNA聚合酶修复。（4）DNA连接酶连接。图,II、无嘌呤无嘧啶碱基缺陷或错配脱碱基（N-糖苷酶）：甲基磺酸甲酯可使鸟嘌呤第7位氮原子烷基化，活化糖苷键，造成脱嘌呤作用；酸也能使DNA脱嘌呤。DNA复制时，DNA聚合酶对dTTP和dUTP分辨力不高，有少量dUTP掺入DNA链。细胞中的尿嘧啶-N-糖苷酶可以切掉尿嘧啶。腺嘌呤脱氨形成次黄嘌呤时也可以被次黄嘌呤-N-糖苷酶切掉次黄嘌呤。对于无嘌呤无嘧啶的损伤有两种修复方法：
21、（1）AP核酸内切酶切开，核酸外切酶切除，DNA聚合酶修复，DNA连接酶连接。（2）插入酶插入正确碱基,三、重组修复P349图1925重组修复的过程切除修复发生在DNA复制之前，而当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位，可以先复制，再重组修复。在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。重组修复至少需要4种酶组分。重组基因recA编码一种分子量为40000的蛋白质，它具有交换DNA链的活力。RecA蛋白被认为在DNA重组和重组修复中均起关键作用。recB、recC基因分别编码核酸外切酶V的两个亚基。此外，修复合成还需要DNA聚合酶和连接酶。,四、SOS反应及其诱导的修复SOS诱导修复是细胞DNA受
22、到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的一系列诱导性修复。SOS反应诱导的修复系统包括：避免差错的修复：SOS反应能诱导光复活切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生，从而加强光复活切除修复和重组修复的能力，这属于避免差错的修复。倾向差错的修复：SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高的突变率，这属于倾向差错的修复。,SOS反应是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。RecA蛋白不仅在同源重组中起重要作用，而且它也是SOS反应的最初发动因子。在有单链DNA和ATP存在时，RecA蛋白被激活而
23、表现出蛋白水解酶的活力，它能分解噬菌体的阻遏蛋白和LexA蛋白。LexA蛋白（22Kd）许多基因的阻遏物，当它被RecA的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表达其中包括紫外线损伤的修复基因uvrA、uvrB、uvrC（分别编码核酸内切酶的亚基）以及recA和lexA基因本身，还有单链结合蛋白基因ssb，与噬菌体DNA整合有关的基因himA、与诱变作用有关的基因umuDC，与细胞分裂有关的基因sulA，ruv，和lon，以及一些功能不清楚的基因dinA，B，D，F等。,SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在极为不利的环境中求得生存的一种基本功能。,第三节 RNA指导的DNA合成（
24、反转录）反转录（reverse transcription）：以RNA为模板，合成DNA。与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。,一、反转录酶具有三种酶活力。（1）RNA指导的DNA聚合酶活力（以RNA为模板，形成RNADNA杂种分子）。（2）RNase H酶活力，水解RNADNA杂种分子中的RNA。（3）DNA指导的DNA聚合酶活力。模板：RNA或DNA引物：RNA或DNA底物：dNTP二价阳离子：Mg2+或Mn2+,二、反转录病毒的基因组结构P353 图19-27（1）反转录病毒基因组通常由两条相同的（+）RNA链组成。5端附近区域以氢键结合在一起，全长7-10Kb。（2）
25、每一条RNA链的两端具有相同的序列，形成正向重复序列。（3）5端有帽子结构，3端有polyA，与真核mRNA相似。（4）5端带有1分子的宿主tRNA，作为反转录时的引物。某些鸟类反转录病毒携带的是tRNAtrp，鼠类是tRNApro,三、反转录病毒的生活周期（RNA 病毒的反转录过程）P354 图19-29（1）病毒粒子侵染细胞，病毒RNA和反转录酶一起进入细胞。（2）RNA被反转录成双链DNA（前病毒），环化，进入细胞核。（3）反转录病毒的DNA整合到宿主染色体DNA中。（4）前病毒DNA进行复制，转录出功能基因、基因组RNA和病毒蛋白。（5）基因组RNA和病毒蛋白在胞质中组装成新病毒粒子，
26、转移到质膜，通过出芽方式释放新病毒粒子。,三、反转录的生物学意义。1反转录酶存在于所有致癌RNA病毒中，它的存在与RNA病毒引起细胞恶性转化有关。2艾滋病毒（AIDS）人类免疫缺陷病毒（HIV），也是一种反转录病毒，主要感染T4淋巴细胞和B淋巴细胞。病毒粒子直径100nm，球状，粒子外包被两层脂质质膜，膜上有糖蛋白（gp120、gp41），另有两层衣壳蛋白p24、p18。HIV基因组由两条单链正链RNA组成，每个链长9.7kb，RNA 5，端有帽子结构，3端有PolyA，链上结合有反转录酶。,3乙肝病毒 大蛋白、中蛋白、主蛋白（表面抗原）核心抗原 双链环状DNA 乙肝病毒与反转录病毒的区别：P
27、355 4、真核生物正常细胞内也存在反转录过程真核生物的谈色体基因组中存在为数众多的逆假基因和逆基因。逆假基因：无启动子和内含子，但有polyA的残基，推测是由mRNA反转录后整合到基因组中去的。逆基因：具有启动子和转录功能，无内含子。可能是由于mRNA反转录后刚好整合到启动子的下游处，或者是带启动子的RNA序列反转录后整合到基因组中,第四节 DNA合成技术一、cDNA文库的构建与特异克隆的筛选1、cDNA合成cDNA：以mRNA为模板，用反转录酶合成第一链，去除mRNA，合成第二链。cDNA文库是获得真核结构基因的最好方法，成熟的mRNA无内含子。,（1）、真核mRNA的分离纯化 rRNA
28、8085%mRNA 15%tRNA及其它小分子RNA 1015%在15%的mRNA中，有1000030000种mRNA。Oligo dT纤维素亲和层析法：加入总RNA，高盐洗脱，先流出非mRNA，降低盐浓度，加入Oligo dA竞争，可洗出mRNA 混合物。免疫法：可分离特定的mRNA。,（2）、cDNA合成（反转录酶）A.自身引物法（S1核酸酶降解法）图Oligo(dT)15-18个核苷酸mRNA5端序列有丢失。B.取代合成法（较常用）图Oliyo（dT）与mRNA3端AAA杂交作为引物，合成第一条DNA链。RNaseH在mRNA上产生多个切口。DNA pol.切口平移，DNA ligase
29、连接，合成出第二条DNA链。T4DNA pol.切去端头的RNA-DNA杂交链。C.引物合成法可以合成全长cDNA，mRNA的5端不丢失。图,D、末端转移酶法,2、cDNA与载体连接3、重组体的转化4、扩增、保存5、获取特定mRNA的cDNA克隆（1）免疫法分离特定的mRNA（2）PCR法（3）sourthern blotting,二、PCR技术（聚合酶链式反应）Polymerase chain Reaction以目的基因或DNA片段为模板，在引物介导及Taq DNA聚合酶催化下，在体外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。,1、反应物（1）模板单、双链DNA或cDNA都可以作为PCR的模板，若以RNA为起始材料，则须经反转录，获得第一条cDNA后才能用于PCR。（2）Taq DNA聚合酶DNA聚合酶是进行PCR扩增的关键，从水生栖热菌（Thermus aquaticns VT-1）分离出来。Taq DNA聚合酶有很好的热稳定性，92.5处理130min，仍保留50%的酶活性，在74活性最高，错误掺入核苷酸的比率为1/7500。（3）引物引物是决定PCR结果的关键，它由寡核苷酸组成，15-30个b（4）核苷酸dNTPdNTP的浓度50-200umul/L。（5）镁离子Mg2+,2、PCR原理图变性 95 复性 55 延伸 72,
