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1、第三篇 基因信息传递,反转录,翻译,DNA,RNA,Protein,中心法则（the central dogma),复 制,1958 F.Crick 1970 H.Temin(逆转录),转录,复制 replication转录 transcription翻译 translation,基因表达调控,基因工程,本篇内容,DNA的生物合成(复制)DNA Biosynthesis，Replication,第 十 章,复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,本章主要内容：,复制的基本规律 DNA复制的酶学和拓扑学变化 复制的过程 逆转录和其他复制方式 D
2、NA损伤（突变）与修复,1 复制的基本规律,一、半保留复制是DNA复制的基本特征,二、DNA复制从起始点向两个方向延伸形成双向复制,三、DNA一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制,半保留复制的的理论设想和实验依据,半保留复制的概念,复制时母链的双链DNA解开成各自作为模板指导子代合成互补链。子代的两条链，一条来自亲代，另一条重新合成。由于碱基互补，子代DNA双链和亲代DNA 碱基序列一致。,知识点1,全保留,半保留,混合式,亲代DNA,子代DNA,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,轻链14N-DNA,重链15N-DNA,轻、重链DNA混合,细菌在含NH4Cl 的普通培养液中培养后
3、提取DNA,DNA半保留复制的证据,将轻链DNA和重链DNA混合,把细菌放在含15NH4Cl 的培养液中培养若干代后提取含15N的“重”DNA,轻链14N-DNA,重链15N-DNA,轻、重链DNA混合,半保留复制第一代DNA,半保留复制第二代DNA,半保留复制第三代DNA,DNA半保留复制的证据,把含15N-DNA的细菌放回含NH4Cl 的普通培养液中培养20分钟后提取子一代DNA,把含15N-DNA的细菌在含NH4Cl 的普通培养液中培养40分钟后提取子二代DNA,把含15N-DNA的细菌在含NH4Cl 的普通培养液中培养60分钟后提取子三代DNA,1958年M.Messelson and
4、 F.W.Stahl 将含14N-DNA(轻链）的细菌放在15N培养液中培养后得到15N-DNA(重链）细菌，提取轻链和重链DNA经密度梯度离心两种DNA处于离心管的不同位置；将15N-DNA再放回14N-培养液中培养，,DNA半保留复制的证据,DNA半保留复制的证据,提取子一代细菌DNA离心，DNA既不在重链DNA的位置也不在轻链DNA的位置，而是在中间位置；提取子二代细菌DNA离心出现了轻链和中间位置，第三代以后轻链带越来越宽，中间带保持不变。重密度带消失了。,L+H,一,二,三,AGAACTTAG,TCTTGAATC,AGAACTTAG,TCTTGAATC,AGAACTTAG,TCTTG
5、AATC,通过半保留复制，子代DNA和亲代的 DNA是一致的,实验结果说明,子一代DNA双链中一股是15N单链，从亲代接受和保留下来的；另一股是14N单链，完全是新合成的。Messelson和Stahl的实验支持半保留复制。,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。在强调遗传恒定性的同时不能忽视其变异性。,1 复制的基本规律,一、半保留复制是DNA复制的基本特征,二、DNA复制从起始点向两个方向延伸形成双向复制,三、DNA一股子链复制的方向与解链方向相反导
6、致半不连续复制,原核生物复制时，DNA从起始点向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,二、双向复制（主要）,复制起点（origin）：指DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列。,知识点2,TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA,串联重复序列,反向重复序列,5,3,5,3,1 13 17 29 32 44 58 66 166 209 245,E.coli 复制起始点 oriC,复制中的放射自显影图像（眼睛状图形）（大肠杆菌DNA经放射性标记后电镜下观察结果）,复制叉指的是DNA双链分成两股各自作为模板，子链沿模板延长形成的Y字形结构,
7、真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon),包括复制起点和终点。复制子是独立完成复制的功能单位。,真核生物的多复制子复制,已完成复制的复制子,DNA母链，ori为复制点,复制子的大小和起始的先后不同,复制子长度为相邻起点间距离，复制子：一个复制起点所作用的DNA 区域；或独立完成复制的功能单位。,复制进程,真核细胞复制子小且复制速度慢,1 复制的基本规律,一、半保留复制是DNA复制的基本特征,二、DNA复制从起始点向两个方向延伸形成双向复制,三、DNA一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制,5,3,解链方向,领
8、头链(leading strand),随从链(lagging strand),冈崎片段,复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。,三、半不连续复制,顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。,领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,知识点3,2 DNA复制的酶学和拓扑学变化,一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键 是复制的基本化学反应,二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合,三
9、、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据,四、复制中的分子解链伴有DNA分子拓扑学变化,五、DNA连接酶连接DNA双链中的单链缺口,1.反应原料：dNTP 2.反应场所：细胞核 3.反应条件：模板：亲代DNA双链打开同时作模板 引物：RNA片段 酶与蛋白因子,一、复制的化学反应,知识点4,4.反应规则 模板作用规则：Chagaff碱基配对原则 反应方向 53,dATPm,dGTPn,dCTPy,dTTPz,+DNA,DNA聚合酶,引物RNAMg2+,DNA,dAMP,dGMP,dCMP,dTMP,+(m+n+y+z)PPi,m+n+y+z,聚合总化学反应：,知识点5,P,P,
10、5,3,A,T,G,C,T,C,A,A,A,G,T,G,A,3,5,3,5,OH,T,C,T,OH,P,5,复制过程的脱氧核苷酸聚合,带斜线的小方框代表引物,dTTP,dATP,dCTP,聚合反应的特点,DNA 新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5 3方向进行；。严格遵守碱基配对原则,2 DNA复制的酶学和拓扑学变化,一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键 是复制的基本化学反应,二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合,三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据,四、复制中的分子解链伴有DNA分子拓扑学变化,五、DNA连接酶连接DNA双链中的单链缺口,二.DNA聚合酶,全称：依赖
11、DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase、DDDP)简称：DNA-pol,活性：1.53 的聚合活性 2.核酸外切酶活性,3 5外切酶活性，能辨认错配的碱基对，并将其水解5 3外切酶活性，能切除突变的 DNA片段。,知识点6,核酸外切酶活性,3 5外切酶活性能辨认错配的碱基对，并将其水解,5 3 外切酶活性能切除突变的 DNA片段。,合成中的DNA分子,（一）原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol DNA-pol DNA-pol,三种酶共同点：都具有 5 3 聚合酶活性3 5外切酶活性,小片段,大片段,DNA-pol（109kD）,H和I螺旋之间有较大的非
12、螺旋区50个氨基酸（未标示出,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,模板链,引物,Klenow片段,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段：Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,木瓜蛋白酶,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,知识点7,聚合酶（polymerase）活性 可以催化脱氧核苷酸的聚合，但速度不快。(10个核苷酸/S)主要功能是填补随从链片断空隙。,知识点8,外切酶活性,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,DNA-pol,DNA-pol（12
13、0kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活 在pol I和pol III缺失情况下暂时起作用参与DNA损伤的应急状态修复（SOS修复）,DNA-pol III,Pol 活性高于Pol 此酶是原核生物DNA复制延长反应中真正起作用的酶。10种亚基组成的不对称二聚体,知识点9,E.coli DNA 聚合酶不对称二聚体,核心酶,-复合物,个核心酶1个-复合物（、5种亚基）可滑动的DNA夹子（含1对-亚基）,DNA聚合酶全酶结构,全酶结构包括：,亚基（130，000）主要功能是合成DNA亚基执行碱基选择功能亚基可能起组装作用,核心酶由、和亚基组成：,2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，
14、其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链。,功能：-复合物是DNA夹子加载蛋白，负责将可沿DNA链滑动的一对-亚基（DNA夹子）加载于DNA，使DNA聚合酶具有持续合成能力。,-复合物由5种亚基组成：、,表10-1 大肠杆菌中DNA聚合酶,Pol Pol Pol酶活性5 3聚合作用 3 5外切酶活性-+5 3外切酶活性-构成（亚基数）单体 单体 多亚基分子大小（103）109 90 900体外链延长速度（核苷酸数/分）600 30 9000分子数/细胞 400？1020功能 校读改错 不详 复制延长 去除引物、填补空隙,(二)真核生物的D
15、NA聚合酶,5种 DNA-pol、DNA-pol:起始引发，有引物酶活性。DNA-pol:延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性DNA-pol:与DNA-pol I相似，在复制过程中起校 读、修复和填补缺口的作用。DNA-pol:线粒体内DNA复制酶DNA-pol:参与低保真度的复制,2 DNA复制的酶学和拓扑学变化,一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键 是复制的基本化学反应,二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合,三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据,四、复制中的分子解链伴有DNA分子拓扑学变化,五、DNA连接酶连接DNA双链中的单链缺口,2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能
16、,1.遵守严格的碱基配对规律,3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制,DNA聚合酶对模板的依赖性是子链与母链准确配对、是遗传信息得以延续和传代的保证。碱基配对的关键是氢键的形成。,1.遵守严格的碱基配对规律,2.核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正,核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。,DNA-pol的校读功能,DNA-pol I,外切活性,聚合活性,dCTP,A：碱基配对错误，DNA-pol I表现外切酶活性，切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物,模板链,新合成链
17、,知识点10,B：如果碱基配对正确，DNA-pol I 则不表现外切酶活性；只表现聚合酶活性。,模板链,新合成链,3.复制的保真性依赖正确的碱基选择,DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,2 DNA复制的酶学和拓扑学变化,一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键 是复制的基本化学反应,二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合,三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据,四、复制中的分子解链伴有DNA分子拓扑学变化,五、DNA连接酶连接DNA双链中的单链缺口,四、与
18、解链有关的酶和蛋白质因子,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。但无论是合成前、合成后，以及合成中的上下游DNA链，都是处于高度旋转、盘曲，高度压缩，并填塞满蛋白质的双股螺旋的超级结构状态。Watson-Crick指出DNA复制最难、最复杂的是解开双螺旋。大肠杆菌复制的实验研究证明了他们的预见。参与模板制作的酶和蛋白因子远比参与复制的酶和蛋白因子多。,原核生物复制其始的相关蛋白质,原核生物复制其始的相关蛋白质,DnaA(dnaA)辨认起始点,DnaC(dnaC)运送并协同DnaB,拓扑异构酶（gyrA,B）理顺DNA链,单链DNA结合蛋白稳定已解开的单链,解螺
19、旋酶DnaB(dnaB)解开DNA双链,注：括号内为该蛋白质的基因，蛋白质名称首字母大写,引物酶DnaG(dnaG)催化RNA引物生成,(一)解螺旋酶（DnaB),解螺旋酶（helicase）,亦称解链酶现已研究证明，E.coli复制时的解链酶，是由dnaB基因编码的，其作用是利用ATP供能解开双链。作用前它需要DnaA蛋白帮助辨认起始点（E.coli的起始点称 oriC,由245 bp组成，其中富含A-T处为解链酶的作用点），还需要DnaC蛋白带到起始点。,解螺旋酶（DnaB)动画,（二）DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),在复制过程中，DNA每复制10bp，复制叉前方的
20、模板DNA双螺旋就要绕其长轴旋转一周，产生正超螺旋。,拓扑是指物体或图像作弹性移位而保持物体原有的性质。通常DNA分子的拧转是适度的。盘绕过分，称为正超螺旋，盘绕不足为负超螺旋。,拓扑学的英文名是Topology，直译是地志学，也就是和研究地形、地貌相类似的有关学科。我国早期曾经翻译成“形势几何学”、“连续几何学”、“一对一的连续变换群下的几何学”。,11个螺旋,超螺旋局部解开后,图10-12 复制过程中正超螺旋的形成,复制过程中正超螺旋的形成,超螺旋解开前,2,9,解链过程中正超螺旋的形成,拓扑异构酶是一种可逆的核酸酶。既能水解、又能连接磷酸二酯键。,DNA拓扑异构酶的作用特点及功能,消除正
21、超螺旋，负超螺旋使复制叉能够顺利前进。,Topo,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状反应不需ATP。,拓扑酶I,图12-13 拓扑异构酶 I 的作用方式,Topo,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。,拓扑异构酶的作用是改变DNA分子拓扑构象，理顺DNA链来配合复制进程。,所有细胞和多数病毒的DNA复制，首先利用模板合成一段RNA引物，这一过程称为引发。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA
22、的碱基顺序相配对。,（三）引物酶-复制起始时催化生成RNA引物的酶,这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子，其作用为：使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，有利于发挥模板作用。保护新生的单链DNA，避免核酸酶的降解。循环利用发挥其保护单链DNA的作用。,（四）、单链DNA结合蛋白（single strand binding protein,SSB）,理顺DNA链,拓扑异构酶,(,gyrA,B),稳定已解开的单链,单链DNA结合蛋白,SSB,催化RNA引物生成,引物酶,DnaG,（dnaG）,运送和协同DnaB,DnaC,（dnaC）,解开DNA双链,解螺旋酶,DnaB,（
23、dnaB）,辨认起始点,DnaA,（dnaA）,蛋白质（基因）,通用名,功 能,原核生物复制起始的相关蛋白质,E.Coli 基因图,umuC,D,dnaC,dnaG,dnaL,mutHmutS,dnaZ,mutL,dnaI,dnaA,dam,rpoA,D,oriC,ter,rep,recCrecBrecD,gyrA,gyrB,recA,lig,uvC,uvB,0/100,10,20,30,40,50,60,70,80,90,dnaA、Z 较早发现的与复制有关的基因gyrA、gyrB-DNA拓扑异构酶基因recA、B 和 uvrA、B、C、D、E-与重组、修复有关的基因。mut（突变子）-和复制
24、保真性有关的基因oriC-复制起始点ter-复制终点,E.coli基因图,DNA拓朴异构酶 解开超螺旋,SSB 保护单链,解开、理顺DNA链、维持DNA单链状态,知识点11,2 DNA复制的酶学和拓扑学变化,一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键 是复制的基本化学反应,二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合,三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据,四、复制中的分子解链伴有DNA分子拓扑学变化,五、DNA连接酶连接DNA双链中的单链缺口,五、DNA连接酶,催化一个DNA片段的3-OH末端和相邻DNA片段的5-P末端生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。需要消
25、耗ATP，只能连接互补链中的单链缺口。在DNA修复、重组、剪接中也起缝合缺口的作用。也是基因工程的重要工具酶之一,知识点12,DNA连接酶,ATP,ADP,ATP,ADP,DNA连接酶,图10-14 DNA连接酶的作用,2 DNA复制的酶学和拓扑学变化,一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键 是复制的基本化学反应,二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合,三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据,四、复制中的分子解链伴有DNA分子拓扑学变化,五、DNA连接酶连接DNA双链中的单链缺口,3 DNA生物合成过程,一、原核生物的DNA生物合成,二、真核生物的DNA生物合成,（一）复制的起
26、始(原核生物）子链DNA的第一个核苷酸在引物末端与模板形成碱基配对并与引物生成磷酸二酯键即标志着起始阶段结束。,需要解决三个问题：1.起始点的识别2.DNA解开成单链，形成复制叉，提供模板。3.形成引发体并合成引物，提供3-OH末端,知识点13,图10-15 E.coli复制起始点 oriC,TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA,串联重复序列,反向重复序列,5,3,5,3,1.DNA解链,1 13 17 29 32 44 58 66 166 209 245,复制起点的一般特征:由多个独特的短重复序列组成。短重复序列被多亚基的复制起始因子所识别并结合。一
27、般富含AT，利于双螺旋DNA解旋，以产生单链DNA复制模板。,DNA解成单链过程 动画,引发体（primosome）=解链酶（DnaB）+DnaA+DnaC+引物酶（DnaG）+模板DNA SSB(多种蛋白因子)引发体即引发复制的多种酶蛋白和蛋白因子与模板起点结合成的复合体，依次激活DnaB解开双链，DnaG合成RNA引物片段的活性。从而为DNApol提供3-OH末端。引物长度一般为10100个碱基。,2.引发体和引物,引发体的生成 动画,参与复制起始的各种蛋白质,（二）复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，以亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。dNTP以dNMP的方式逐
28、个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶。,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,3,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH 3,DNA-pol,复制的延长,在复制叉同时合成前导链和随从链,由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为1
29、00个核苷酸。,复制叉,复制的延长 动画,（三）复制的终止,切除引物、填补空缺、连接切口,Tus蛋白具有反解旋酶（contra-helicase）活性，识别并结合ter序列中共有序列，阻止DnaB蛋白的解旋作用，从而抑制复制叉前进。Tus蛋白除了使复制叉停止运动以外，还可能造成复制体解体。,Tus蛋白识别复制终点使复制终止在复制叉汇合点两侧约100kb处各有一个终止区（ter D/A和ter C/B）。,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,（1）去除引物，填补缺口：在原核生物中，由RNA水解酶水解去除RNA引物，并由DNA聚合酶催化延长引物缺口处的DN
30、A，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。,（2）连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,冈崎片断的连接,5,5,RNA酶,水解RNA引物，留下空隙,填补引物水解后留下的空隙，保留缺口,形成磷酸二酯键连接片段之间缺口,复制的终止 动画,3 DNA生物合成过程,一、原核生物的DNA生物合成,二、真核生物的DNA生物合成,真核生物复制子多、引物和冈崎片段的长度均小于原核生物、复制叉前进速度慢等；真核细胞在复制时，还同步合成组蛋白，形成核小体；切除冈
31、崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H和FEN1等。,真核生物与原核生物DNA复制的差异,知识点14,Pol/引发酶 合成RNA-DNA引物Pol 合成前导链和后随链，解旋酶活性 Pol 填补引物空隙，切除修复、重组RPA 稳定解旋后的单链DNARFC 识别引物DNA的3端并驱除Pol PCNA（增殖细胞核抗原）在复制起始和延长中起关键作用RNase HI/FEN1 切除冈崎片段5端的RNA引物DNA连接酶 封口解旋酶 复制叉的形成和移动必不可少拓扑异构酶 释放复制叉前进时产生的扭曲应力,真核生物复制过程中酶及功能,复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需
32、拓扑酶和复制因子(replication factor,RF)。增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。,（一）真核生物复制的起始与原核基本相似,DNA-pol和pol分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol通过PCNA的协同作用，逐步取代pol，在RNA引物的3-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由pol催化合成。然后由PCNA协同，pol置换pol，继续合成DNA子链。,（二）真核生物复制的延长发生DNA聚合酶/转换,领头链,随从链,亲代DNA,在真核生物的复制子上，亲代染色
33、体的核小体被逐个打开，组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNA的前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因此，DNA的复制是半保留的，而组蛋白则是全保留的。,复制过程中组蛋白的装配,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,（三）复制的终止,切除引物的两种机制,线性DNA复制的末端,复制完成后子链末端留下空隙，母链成单链,线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。细胞经多次分裂后，端粒缩短达到危机点(crisis)，促发某一信号，使细胞逐渐失去增殖能力而衰老死亡。端
34、粒酶可延长染色体末端DNA，（能延长缩短的端粒，缩短的端粒其细胞复制能力受限），从而增强体外细胞的增殖能力。,端粒和端粒酶是近年来生命科学研究的热点。对端粒和端粒酶系统的研究，有助于阐明细胞衰老和恶变机制，对肿瘤的诊断、治疗以及抗衰老都具有重要的理论和实际意义。,端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。,真核生物的端粒,知识点15,结构特点,由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。,知识点16,端粒酶(telomerase),端粒酶的分子结构,端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过
35、逆转录过程对末端DNA链进行延长。端粒酶通过爬行模型的机制维持染色体的完整。,端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),端粒酶的组成,端粒酶的作用机制爬行模型,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,端粒DNA末端,1.端粒酶靠与母链DNA端粒结合,内在模板RNA,2.以端粒酶RNA为模版，逆转录，延长DNA母链,3.端粒酶移位、空出RNA模板，再次延长母链，同时DNA母链
36、反摺利于下游复制延伸。,4.延伸足够长度后端粒酶脱离母链，代之以DNA-Pol。此时母链3-OH反折，同时作为引物和模板，完成末端双链复制。,DNA-Pol,4 逆转录和其他复制方式,一、逆转录病毒的基因组是RNA，其复制方式是逆转录,二、逆转录的发现发展了中心法则,三、噬菌体DNA按滚环方式复制和线粒体DNA按D环方式复制,遗传信息从RNA流向DNA称逆转录（reverse transcription）,催化逆转录反应的酶称逆转录酶（reverse ranscripase），或称RNA指导（依赖RNA）的DNA聚合酶（RNA dependent DNA Polymerase，RDDP）,RN
37、A,DNA,逆转录酶,1.以RNA为模板2.dNTP为原料3.遵从碱基配对原则,逆转录酶的特点,4.具有三种催化活性：以RNA为模板催化合成一条与之互补的 DNA链，形成RNA/DNA杂化双链；催化杂化双链中的RNA水解；以留下的DNA链为模板，合成与之互补的DNA，形成互补双链DNA，即cDNA(c,即complementary),知识点17,逆转录酶的结构,逆转录酶催化的cDNA合成,RNA模板,RNA,DNA,反转录酶,RNaseH,单链DNA,双链DNA,反转录酶,杂化双链,4 逆转录和其他复制方式,一、逆转录病毒的基因组是RNA，其复制方式是逆转录,二、逆转录的发现发展了中心法则,三
38、、噬菌体DNA按滚环方式复制和线粒体DNA按D环方式复制,逆转录作用的生物学意义,逆转录酶及逆转录现象的发现扩展了经典的生物中心法则，表明RNA同DNA一样，是一种具有储存、传递和表达遗传信息的生物遗传物质，加之20年前发现的具有催化作用的RNA（ribozyme），使人们有理由认为RNA在生命活动及生命起源中有着十分重要的作用。,逆转录酶的发现，在建立RT-PCR技术，构建cDNA基因文库及应用逆转录病毒载体作基因治疗等分子生物学和分子医学领域中发挥了十分重要的作用，得到了越来越广泛的应用。对逆转录病毒的研究拓宽和加深了病毒致癌领域，发现了基因，对搞清AIDS等人类免疫缺陷病的发病机理、探索
39、有效治疗方法有着重要的指导意义。,4 逆转录和其他复制方式,一、逆转录病毒的基因组是RNA，其复制方式是逆转录,二、逆转录的发现发展了中心法则,三、噬菌体DNA按滚环方式复制和线粒体DNA按D环方式复制,双链DNA是大多数生物的遗传物质。某些病毒的遗传物质是RNA。少数低等生物如M13噬菌体的感染型只含有单链DNA。染色体外DNA（原核生物的质粒、真核生物的线粒体）都采用特殊的方式复制。,三、噬菌体DNA按滚环方式复制和线粒体DNA按D环方式复制,滚环复制(rolling circle replication),滚环复制和D环复制,是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,3-O
40、H,5-P,滚环复制,D环复制(D-loop replication),是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,5 DNA的损伤与修复,一、突变在生物界普遍存在,二、多种化学或物理因素可诱发突变,三、引起突变的分子改变类型有多种,四、DNA损伤的修复有多种类型,突变:是指DNA分子中碱基序列的改变，从而影响其表达产物的结构与功能。也称为DNA损伤（DNA damage）。,知识点18,DNA保真与突变（mutation）是生物物种稳定与进化的对立统一自然现象。DNA损伤的结果:导致复制或转录障碍，导致复制后产生基因突变,突变导致死亡，突变是某些疾病的发病基
41、础。突变就其后果而言并非都是危害生命的，也有积极意义，且在生物界普遍存在。,5 DNA的损伤与修复,一、突变在生物界普遍存在,二、多种化学或物理因素可诱发突变,三、引起突变的分子改变类型有多种,四、DNA损伤的修复有多种类型,1自发因素：(1)自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。(2)自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。(3)复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。,一、引起突变的因素,2物理因素：由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。紫外线常常
42、引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。,3化学因素：(1)脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速A 脱氨基生成次黄嘌呤。C 脱氨基生成U，,A-T配对将变为 I-C配对,碱基的转换,C-G 配对将变为 U-A 配对,(2)烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。(3)DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。(4)碱基类似物：如5-FU，6-MP等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。(5)断链剂：如过氧化物，含
43、巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。,苯并芘,苯并芘-7,8-二醇,DHEP-BP,苯并芘由一个苯环和一个芘分子结合而成可通过吸入、食入、经皮吸收等多种途径进入人体。1933年，英国学者从煤焦油中分离出苯并芘 BaP，并诱发出小鼠皮肤癌，使BaP成为第一个被发现的环境化学致癌物。在已查出的致癌物中，有一半以上是多环芳烃类化合物。BaP不仅是其中毒性最大的一种，也是所占比例较大的一种，约占全部环境中致癌多环芳烃类化合物的20。,苯并芘及其致癌性,研究证实，BaP在整个代谢过程中产生的多数中间产物无致癌性，仅有少数能转化成终致癌物。BaP为前致癌物，在体内经代谢转化后可转化为终致癌物。BaP还具有
44、致畸性和致突变性。,BaP主要存在于煤焦油、各类碳、煤、石油等燃烧时产生的烟气、汽车尾气中，也存在于工业废水中.香烟在吸烟时产生的烟雾中含有多种致癌物，其中最具有代表性的就是BaP。厨房油烟食用油在200左右的高温下可发生一系列化学变化并产生油烟。因此，油烟携带着大量BaP，厨房空气中BaP的含量比普通房间高好几倍,离我们最近的苯并芘,烧烤和熏制食品烤羊肉串和炸油条时，冒出的油烟里附带大量的BaP，羊肉串和油条上也有这种强致癌物。在用炭火烤制的肉食中，BaP可达2.61.2g/kg,在烤糊的食品中，BaP的含量比普通食物增加1020倍。这是因为在烤制过程中，除木炭燃烧产生的BaP外，还有其他多
45、环芳烃类物质可直接污染食品，肉中的脂肪过度受热也能产生BaP。,尽管BaP具有强致癌性，但是只要我们注意减少接触，就能够阻止BaP发生致癌作用。控制工业污染物排放、限制街头烧烤.戒烟或劝阻吸烟。少吃烧烤和熏制食品。炒菜时不要让油温过高。注意厨房通风，有条件的应在做饭时使用抽油烟机,关爱健康 远离苯并芘,5 DNA的损伤与修复,一、突变在生物界普遍存在,二、多种化学或物理因素可诱发突变,三、引起突变的分子改变类型有多种,四、DNA损伤的修复有多种类型,错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement),三、突变的分子改变类型,知识点19,
46、DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation),发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。,1.转换,发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。,2.颠换,（一）错配,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,N-val his leu thr pro Val Glu C,肽链,CAC GTG,基因,正常成人Hb(HbA)亚基,N-val his leu thr pro Glu Glu C,肽链,CTC GAG,基因,模板链编码链,模板链编码链,膀胱癌细胞c-rasH基因点突变,（二）缺失、插入和框移,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,插入：
47、原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致框移突变。,正常,缺失C,C,缺失使阅读框前移插入使阅读框后移缺失或插入点以后的密码全部改变,（三）重排,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,5 DNA的损伤与修复,一、突变在生物界普遍存在,二、多种化学或物理因素可诱发突变,三、引起突变的分子改变类型有多种,四、DNA损伤的修复有多种类型,四、DNA损伤的修复,修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,知识
48、点20,DNA损伤的修复方式可分为直接修复和 取代修复两大类。,光复活,直接修复,转甲基作用,直接连接,无差错修复,切除修复,取代修复,重组修复,有差错倾向修复,SOS修复,（一）直接修复：,这是一种广泛存在的修复作用，能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。修复过程由光修复酶(photolyase)催化完成。,1.光修复（light repair）,其修复过程为：光修复酶(photolyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物。在300600nm可见光照下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开。光修复酶从DNA上解离,病例：8岁的女孩毛毛脸上和身上长满了黑斑，密密麻麻，几乎布满全身，皮肤发痒。毛毛出
49、生5个月后，脸上开始出黑色的斑点，逐渐增多，后来向全身蔓延，暴露部位较重，黑斑刚开始出现时为小米粒大小的透明疙瘩，有明显瘙痒。,着色性干皮病(xeroderma pigmentosum,第一个发现的DNA修复缺陷性遗传病，是一种罕见的常染色体隐性遗传性皮肤病。患者皮肤和眼睛对太阳光特别是紫外线十分敏感，身体暴光部位的皮肤干燥脱屑、色素沉着、容易发生溃疡、皮肤癌发病率高，常伴有神经系统障碍，智力低下等，病人的细胞对嘧啶二聚体和烷基化的清除能力降低。,着色性干皮病(xeroderma pigmentosum,着色性干皮病(XP）,着色性干皮病的生化基础是?,DNA损伤修复所需的核酸内切酶缺乏-于是
50、人体细胞在各种刺激，特别是最常见的紫外线照射下产生的DNA损伤便无法得到修复，细胞大量死亡，故产生着色性干皮病的临床表现。部分DNA损伤后可以导致细胞癌变，因此很多着色性干皮病患儿在10多岁左右便发生各种皮肤癌，包括基底细胞癌、鳞状细胞癌甚至恶性度极高的黑素瘤，这些肿瘤可以多种同时发生。,2转甲基作用：在转甲基酶的催化下，将DNA上的被修饰的甲基去除。此时，转甲基酶自身被甲基化而失活。3直接连接：DNA断裂形成的缺口，可以在DNA连接酶的催化下，直接进行连接而封闭缺口。,（二）切除修复,是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。,E.coli的切除修复机制,知识点21,
