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1、第3讲 动物人工繁殖,对于人类，世界范围内不孕夫妇占10左右，需要建立人工助孕技术。,看一个视频：体外授精婴儿http:/,动物人工繁殖的技术方法一览：,第一部分体外受精动物,一定义,世界上首批试管动物,二优点,三知识回顾,四试管动物培育流程,1精子的采集与体外获能处理,体内获能,体外获能,此外还有高渗溶液处理法。,2卵子的回收与成熟培养,在母畜（供体）发情周期的某一时期，用外源性的促性腺激素处理，从而促使其卵巢上较正常有更多个卵泡同时发育，并且能够同时排出多个具有受精能力的卵子，这一技术称为超数排卵，简称“超排”。超数排卵方法：以牛为例 发情后913天开始；常用的激素为卵泡刺激素 FSH；注
2、射方法一般是连续3d递减注射,每天2次,间隔8-12小时（半衰期短）。其他激素：孕酮，雌二醇、促性腺激素释放激素等。,（3）从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞以鼠为例，一般为了防止干燥，可将屠杀后取出的输卵管放在平皿内，用石蜡油覆盖，在实体显微镜下找到输卵管膨大部，用磨尖的钟表镊子，切开输卵管膨大部，使内容物溢出而找到卵。对于屠宰场中的大中型动物，可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手术后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。,卵母细胞体外成熟培养,卵母细胞体外培养：通常采用微滴培养法，微滴体积一般为50-200微升，每个微滴中一般放入10-40个卵母细胞。二氧化碳培养箱培养，条件为39、100%湿度、5%
3、二氧化碳。成熟标志：极体排出、透明带软化、卵丘细胞层扩散靠近卵母细胞周围的卵丘细胞呈放射状排列，出现放射冠，用DNA特异性染料染色后，在显微镜下进行核相观察，可见卵母细胞处于第2次成熟分裂中期。,3试管动物的体外受精,辅助受精技术,是通过人为方法使精子和卵子完成受精过程，由于一般都需要借助显微操作仪来完成，所以又称辅助受精技术为显微授精(microinsemination)。,4胚胎培养,内细胞群,2.雌原核与雄原核融合,3.卵裂开始,4.2细胞期,极体,透明带,极体,卵裂球,受精卵,原核,卵周腔,5.4细胞期,6.8细胞期,滋养层,7.桑椹胚,胚泡腔,8.囊胚,1.雌原核与雄原核形成,发育阻
4、滞问题,不同动物体外发育阻滞出现的时期不同，小鼠为2细胞期，大鼠为8细胞期，牛和绵羊为816细胞，猪为4细胞期。,5胚胎移植,（6）体内发育、出生,胚胎移植后处理与观察：胚胎移植后需补充黄体酮，目前多采用注射法给予黄体酮。胚胎移植后14天，可由验尿或抽血确定是否妊娠。如果确定妊娠，则改用hCG继续补充到怀孕10周。妊娠后14天，B超检查胎儿数及胚胎着床部位。,牛胚胎移植技术路线示意图,胚 胎 移 植 的 程 序,优良种公畜,供体（优良母畜）,超 数 排 卵 处 理,发 情、配 种,胚 胎 回 收,超 数 排 卵 处 理,受体（优良母畜）,同 期 发 情 处 理,发 情,胚 胎 移 植,优 良
5、后 代,胚胎分割技术,所谓胚胎分割（embryo splitting）即是将一枚胚胎用显微手术的方法分割成二分、四分甚至八分胚，经体内或体外培养，然后移植入受体中，以得到同卵双生或同卵多生后代的技术，也是胚胎克隆的一种方法。,胚胎分割基本过程,代孕母牛,胚胎分割过程,胚胎分割 一卵双生,五试管婴儿,六 动物性别控制,所谓性别控制，就是通过人为干预或操作手段使母畜繁殖所需要的后代。,性别决定机制,性别控制途径,性别控制主要有两条途径：1-授精前性别控制：选择X、Y精子2-胚胎移植前性别控制：在移植前对胚胎进行性别鉴定，然后对所需要性别的胚胎进行移植，从而达到控制后代性别的目的，这是动物性别控制较
6、为实用的方法。,1 X-Y精子的分离,X-Y精子在物理和化学上存在差异，例如：精子的耐酸碱性，Y精子有嗜碱性，而X精子有嗜酸性。可以采用相应的方法分离，选择相应的雄性配子，进行体外受精，就可以实现性别控制。,离心分离法,电泳分离法,免疫学分离法,流式细胞仪分离法,2 胚胎性别鉴定,细胞生物学方法：通过判定胚胎细胞性染色体是还是来鉴定胚胎的性别。分子生物学方法：根据Y染色体上的SRY基因的有无进行鉴别，可以采用PCR或FISH（荧光原位杂交）等分子方法进行确定性别。免疫学方法：H-Y抗原,七 有关伦理学问题讨论生物伦理学医学伦理学,妇女解放,人造子宫：高级水族箱？,这些“婴儿孵化器”可能将取代天
7、然子宫，授精将成为一种临床操作，而分娩也不再有痛苦；怀孕将不再只是女人的专利。男人也能通过手术植入人造子宫，并独立地怀孕生孩子。,讨论题,1-你怎样看待通过代孕母生育的孩子与亲 生母亲的关系?2-对单性生育怎样看?是否同意?3-你是否赞成通过性别控制来获得后代?,视频学习网站,体外受精http:/,第二部分,核移植动物,一定义,与其他克隆的区别,通过植物组织培养再生植物属于植物个体的克隆。克隆动物一般指采用核移植、胚胎移植技术得到的动物。核移植主要包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植。利用胚胎分割得到的动物属于广义上的克隆动物,二克隆动物的发展历史,1早在1892年，Driesch和 Wilson
8、就分别对海胆和文昌鱼分离卵裂球的进行了动物克隆的尝试。21938年，德国胚胎学家斯佩尔曼（Spemann）经提出“分化细胞的核移入卵子中能否指导胚胎发育”这样的设想，并在两栖类脊椎动物进行了克隆动物实验，由于当时技术等方面的原因使他没能找到将细胞核导入卵细胞的方法。,里程碑式的突破,猕猴特拉,克隆猪,老鼠库姆利纳,母牛诺托和卡加,兔子,克隆猫科毕,克隆马普罗梅蒂亚,克隆鹿杜威,克隆狗史努比,三技术流程,1核供体细胞获得与取核 供核细胞可以是动物原代细胞或传代细胞。分离制备单个动物细胞，体外培养得到正常二倍体体细胞系，然后进行15 天的缺血饥饿培养，诱使细胞处于“静止”状态（一般进入G0 期）。
9、采用细胞松弛素B（Cytochalasin B）诱发细胞排核或者显微操作取核等方法得到细胞核。,四 胚胎细胞克隆动物,五体细胞克隆动物,体细胞克隆：是将动物体细胞经过抑制培养使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，培育成早期胚胎，将胚胎移植至受体，妊娠产仔培育出与核供体一样的成体动物的一种细胞工程技术。,1 意义,2基本过程,应用举例：多莉羊技术路线,1-供核细胞获得与取核,2-卵母细胞收集与去核,3-细胞核融入卵细胞,4-重构胚的培养,5-妊娠监护,四 克隆有关伦理学问题讨论,讨论题：,1-动物可以无休止地被克隆吗？2-你是否同意生殖性克隆？无性生殖是人类的倒退？3-英雄、
10、伟人可以通过克隆再生吗？,关于端粒,克隆动物存在的问题（1）技术尚不成熟,（2）遗传、疾病问题,（3）克隆人带来的社会、伦理学问题人类胚胎克隆与克隆人,克隆人？,“多利羊”制造者反对克隆人伊斯维姆.穆特,“我认为，已经有足够的证据表明，克隆人的行动是完全不负责任的。”他说，克隆技术目前还存在很多不确定因素，他们在对动物进行实验时经常遇到大量畸形或异常情况，因此克隆技术目前不适合用于人类。,“试管婴儿之父”反对克隆人罗伯特爱德华,爱德华教授认为，试管婴儿技术与人类现存的生育伦理没有冲突，而且还给不孕者带来福音。克隆人则是一种无性繁殖技术，违背了人类的生育伦理，因而应受到指责。,问题3：技术上可以保证遗传信息完全一样的个体的复制。性格等是有环境、社会、机遇等决定的，是很难复制的。,本节小结,1-体外受精动物的培育：精子获能与卵细胞成熟培养、体外受精方法、性别控制的原理与方法2-核移植动物的培育：,五、细胞工程的基本技术,
