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1、一氧化氮生物系统及其药理作用,一氧化氮（NO）是具有高度反应性的自由基，在体内经NO合酶催化，从L-精氨酸产生。NO作为细胞信使，介导环磷鸟苷（cGMP）生成的增加，发挥生物学作用。,一、NO的生物学特性,（一）NO的生成第一步反应，NOS接受NADPH提供的电子，使酶分子中的FAD/FMN还原，在Ca2+/CaM和O2的协助下，使L-精氨酸末端胍氨基的氮原子羟化，形成中间产物N-羟基-L-精氨酸（NHA）。第二步反应，NHA在NADPH和四氢蝶呤的协助下进一步氧化，生成NO和胍氨酸（图9-1）。,（二）NO的代谢很快被氧化代谢，半衰期35s。代谢产物为硝酸根和亚硝酸根。NO还可与亚铁血红素和
2、-SH键结合而失活。,（二）NO的信号转导机制,NOS的生物学特点,分类内皮型（endothelial NOS，eNOS），又称型NOS、NOS-3，主要存在于血管内皮细胞、血小板、心肌内膜及脑和神经组织中。,神经元型（neuronal NOS，nNOS），又称I型NOS、NOSL-1、bNOS，主要存在于脑、脊髓和外周非肾上腺素非胆碱（NANC）能神经，当相应神经元需要时，催化产生极微量（picomolar）的NO。,诱生型NOS（inducible NOS，iNOS），又称型NOS、NOS-2、macNOS、hepNOS，存在于除神经元外的多种组织中，正常情况下不表达，但在炎症和免疫反应剌
3、激下，iNOS mRNA被诱导表达。,根据NOS表达调节以及精氨酸类似物对其抑制的IC50值，将eNOS和nNOS归为原生型NOS（constitutive NOS，cNOS）。,被内毒素和细胞因子（cytokines）激活的巨噬细胞，以及肝实质细胞、免疫细胞和平滑肌细胞中，炎性细胞因子和内毒素诱导iNOS表达。,必须指出，对NOS的传统分型并不是绝对无误的，因为已有不少实验证实，eNOS的激活可以不依赖Ca2+。iNOS在人支气管上皮细胞有原生型表达。,2.NOS基因和NOS结构,NOS cDNA分子克隆证实至少有3种基因编码NOS家族，即nNOS、iNOS和eNOS。三者之间约有50左右的
4、同源性。nNOS和eNOS之间同源性更高，约60。而对于每1种NOS，种属之间的同源性可达8094。,其竣基端1/2侧与细胞色素P-450还原酶相似，同源性约36%，这一部分是相当保守的。,氨基端1/2侧还含有血红素、CaM、四氢蝶呤、L-精氨酸的结合序列，但其定位不是很明确，尤其是四氢蝶呤和L-精氨酸。比较几种NOS的N末端发现，nNOS比其他NOS多出一部分约232个氨基酸，还不清楚此差异的意义。,（三）NO生成的调节,精氨酸/NO通路可被L-精氨酸拟似物及其他化合物抑制，最常用的NOS抑制剂为N单甲基L精氨酸（N-monomethyl-L-arginine，L-NMMA）。拟似精氨酸胍基
5、部分的非氨基酸化合物也能抑制NOS，如氨基胍（aminoguanidine），这些抑制剂常被作为NO生物学研究工具药，其中对iNOS有选择性抑制作用的一些药物有临床应用前景（表9-3）。,表9-3常用NOS抑制剂与NO-sGC汇抑制剂,表9-3常用NOS抑制剂与NO-sGC汇抑制剂(续),表9-3常用NOS抑制剂与NO-sGC汇抑制剂(续),表9-3常用NOS抑制剂与NO-sGC汇抑制剂(续),一、NO的灭活,NO可被体内多种物质如超氧阴离子、血红素、各种含铁血红素酶巯基化合物灭活，半衰期仅数秒，故仅限于局部发挥作用。,内源性NOS抑制物及其代谢酶系统,内源性抑制物：非对称二甲基精氨酸（asy
6、mmetric dimethyl arginie，ADMA）和N-单甲基-L-精氨酸（L-N-nitro-arginine methyl ester，L-NAME)内源性抑制物在调节体内NO合成中起关键作用。,代谢酶系统：蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMT）催化，S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，催化蛋白或多肽中的精氨酸残基甲基化，最后经蛋白酶水解而产生ADMA。PRMT I催化产生非对称二甲基精氨酸（ADMA）PRMT II催化产生对称性二甲基精氨酸（SDMA），SDMA不具抑制NOS生物活性。,代谢酶系统：ADMA经二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）水解成胍氨酸和二甲胺。,图9-2 细胞内NO合成
7、调节系统,L-精氨酸 O2,NOS,NO,ADMA,L-胍氨酸和二甲胺,DDAH,（-）,（-）,二、NO的生物学作用及其机制,NO是具有高度反应性的自由基，在体内广泛存在，为一种细胞信号分子。,（一）作为化学介质调节心血管系统,NO生物学效应主要通过提高环磷鸟苷（cGMP）水平来实现。NO与其靶酶（可溶性鸟苷酸环化酶，sGC）上亚铁血红素的亚铁基结合，sGC变构激活，在Ca2+参与下，催化三磷酸鸟苷酸环化为cGMP。,1.维持血管平滑肌紧张度,（1）血管松弛：NO即为EDRF。在化学或血管张力剌激下，血管内皮生成NO，进入相邻的平滑肌细胞后，cGMP水平升高，激活下游蛋白激酶，最终引起肌球蛋
8、白的轻链去磷酸化，引起血管平滑肌松弛。NO与内皮素（endothelins）保持动态平衡：若血管内皮受损或功能缺陷（eNOS活性低下），则NO合成减少，内皮素的缩血管作用相对占优势。,（2）控制血管有关的血流动力学特性,红细胞在肺中被氧化，血红蛋白亚硝基化，并在血流中循环，在动静脉运输中释放NO基团。血红蛋白的这种变构和带电子性质，与调节血管、控制血压及高效地将氧送到组织有关。这种血红蛋白NO相关活性传递，显示S亚硝基血红蛋白可能有治疗意义。,（3）调节离子通道开放,K+通道被NO打开，是心外膜较大冠脉舒张的主要原因。在基底动脉，NO可降低L型Ca2+通道开放，从而控制血管紧张度。,（4）血管
9、紧张素相互作用,在高血压大鼠，观察到NO通过两种方式与血管紧张素相互作用，一是在平滑肌水平抑制对方的直接作用；二是通过增加对方合成与释放，而间接增强对方的作用，从而控制血管紧张度及全身循环。,2.抑制心肌收缩力：,心肌中存在eNOS和iNOS。通过cGMP，激活蛋白激酶G，降低心肌L型钙电流，从而降低收缩力。改变心肌收缩蛋白对Ca2+的亲和力。激活cAMP磷酸二酯酶，降低细胞内cAMP水平。NO代谢为过氧亚硝基阴离子（ONOO-），使心肌收缩蛋白硝基化。,3.对心肌细胞凋亡的调控：,促凋亡和抗凋亡双重作用。NO代谢为过氧亚硝基阴离子（ONOO-），直接促进调亡。通过其他途径诱导凋亡。通过上调B
10、cl-2表达，抑制L型钙通道，阻止细胞色素C释放，caspas S-亚硝酰基化来阻止调亡发生。,4.抑制血小板聚集和粘附,血管内皮持续合成NO至血管腔内表面，血小板本身也能合成NO，抑制血小板在血管内皮聚集和粘附，有抗血栓形成作用。NO的这种生物学效应，在不影响血压的生理浓度时就十分显著，具有临床应用前景。,5.抑制血细胞黏附,NO能抑制P-选择素介导的中性粒细胞的黏附作用。抑制黏附分子CD1、CD18等的表达等。,6.调节血管平滑肌细胞增生,NO能抑制血管内皮细胞合成胶原蛋白，抑制血管平滑肌细胞的增殖。故有抑制血管损伤初期的血管平滑肌过度增生作用。,7.促进血管增生,NO在血管内皮生长因子（
11、VEGF）下游介导其促血管生成作用。NO还在上游促进VRGF表达增强。,8.清除氧自由基,3NO+O2-+H2O 3NO-+2H+当NO增多时，通过清除自由基而抑制细胞膜脂质过氧化。,（二）NO与心血管系统疾病,1.心脏发育不良,NO调控胚胎心脏发育。eNOS敲除小鼠模型易发生主动脉、二尖瓣畸形。,2.动脉粥样硬化,危险因素使ADMA经二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）减少，减少NO合成，O2-增加，损伤血管。,3.高血压,高血压的形成是一个复杂的病理生理过程。一旦内皮细胞促进血管收缩的因子释放增加（如内皮素、Ang II等），而NO不能相应增加时可能导致高血压的发生和发展。,4.缺血再灌注
12、损伤,再灌注时，O2-增加并和NO生成ONOO-，产生细胞膜脂质过氧化，导致NO释放减少，引起血小板黏附/聚集、冠脉流量减少、缺血加重和收缩功能障碍。炎症时iNOS活化，产生过量NO，生成ONOO-而加重细胞膜损伤。,三、eNOS和DDAH遗传多态性与心血管疾病,eNOS基因G894T和T786C突变以及4ab多态性与冠心病发生有关。二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）基因也被认为是一个心血管疾病相关基因。,四、NO与神经系统,1.中枢神经系统,中枢神经系统存在精氨酸/NO通路。主要分布在小脑、上下丘脑、嗅球的粒细胞层、大脑皮质、海马、垂体后叶和视网膜的自主神经纤维。脑血管和胶质细胞的eNOS
13、和iNOS也生成NO，对脑血流及炎症反应起调节作用。,NO在中枢所起的生物学作用主要有以下几个方面：,（1）NO作为一种神经信息传递物质：参与新的记忆形成，但不影响对记忆的保持。NO还是一种特异的逆行信使，强化突触前谷氨酸释放。在此处nNOS的活化，与N甲基D天冬氨酸（NMDA）型谷氨酸受体有关。随着突触后NMDA受体的活化，激活Ca2+内流，从而激活nNOS，合成释放NO。产生的NO扩散至突触前末梢并活化sGC，使得cGMP水平升高，增加谷氨酸释放，这在海马和纹状体尤为明显。海马的长时程增强（long-term potentiation，LTP）是一种长期突触调节形式，NO作为一种扩散信号，
14、将LTP扩散至相邻神经元的突触。,（2）影响中枢神经递质的释放NO供体可诱导皮层神经原GABA或AChde释放在海马可促进去甲肾上腺素的释放在纹状体可增加多巴胺的基础释放,（3）对NMDA（N-甲基D-天门冬氨酸，N-methyl-D-aspartate)受体通道的调解作用在中枢神经系统中，广泛存在着NMDA受体，NMDA受体的兴奋与抑制不仅与神经元本身的生长和突触的塑造有关，而且还与大脑的认知功能、大脑的发育以及中枢神经系统损伤时神经细胞的死亡或凋亡有关 NO供体药物可使NMDA受体电流减少。,（4）对脑血流的调节作用维持脑血管的舒张状态脑局部区域血流量调节缺血时NO短暂增高，可对抗缺血损伤
15、,（5）参与一些行为调节：下丘脑是中枢最富含NOS的区域之一，其中室旁核中NOS的活性正常与否，与阴茎勃起及哈欠等行为有关。鉴于吗啡作用于室旁核受体，可拮抗阿朴吗啡和缩宫素诱导的阴茎勃起和哈欠，表明吗啡的作用是由于下丘脑室旁核中NO的一种下调的活性所介导的。,（6）维持与强化痛觉脊髓浅表及背侧根神经节存在NOS。该处局部产生的NO与脊髓感受神经元对疼痛感觉过程有关。来自外周纤维记录痛觉和异位冲动发放，通过脊髓NMDA(N-methyl-D-aspartate receptor)受体活化或延伸传人的输入，产生痛觉强化。,（7）对自主神经的作用通过参与前列腺素介导的交感神经的活化作用，中枢NO尚能
16、抑制外周迷走神经引起的胃酸分泌作用。,（8）对神经原的细胞毒性作用在许多病理情况下，NO可造成或加重神经元的损伤和死亡。nNOS敲除小鼠在脑梗死模型中，脑梗死体积比正常小鼠下降40%。,2.外周神经系统,外周植物神经中，有一类能表达nNOS的非肾上腺素非胆碱（NANC）能神经，其突触前末梢合成释放的NO，作为神经递质可对许多NANC能神经支配的器官产生特殊的生理作用。,（1）调节胃肠道功能,胃肠道肠肌层NANC神经去极化，释放的NO作为神经递质，可产生与胃肠道蠕动有关的松弛。,（2）调节呼吸道功能,在人类呼吸道，NO作为一种抑制性递质，起着重要的调节作用。NANC能神经释放NO不仅能松弛气道平
17、滑肌，还能抑制胆碱能神经释放乙酰胆碱。胆碱能神经过多释放乙酰胆碱是支气管哮喘中气道高反应性的重要机制之一。,（3）调节生殖泌尿道功能,分布至阴茎的盆神经丛含有高浓度的nNOS。NO是调节阴茎勃起的NANC能神经递质，其机制是NANC能神经纤维Na+通道活化，释放NO引起阴茎海绵体松弛，血液流入而导致阴茎勃起。,（4）胰岛素分泌过程的重要调质,内分泌细胞和胰岛神经中有NOS活性，NO是胰岛素分泌的抑制性调质。体内S亚硝基硫醇的形成，改变了细胞关键的细胞内和/或膜巯基的平衡。生理量的自由基NO和H2O2决定着体内还原型和氧化型谷脱甘肤（GSH/GSSG）比值降低或升高，在胰岛素分泌过程中起重要的调
18、节作用。,（5）抑制嗜铬细胞释放儿茶酚胺,乙酰胆碱或去极化可引起嗜铬细胞释放儿茶酚胺及钙内流。肾上腺嗜铬细胞和内皮细胞间存在功能上的相互作用，并存在与之有关的NO/鸟苷酸环化酶通路。嗜铬细胞邻近的内皮细胞及神经末梢中的心房利钠肽和NO，能通过鸟昔酸环化酶活化，并抑制Ca2+经由电压活化的钙内流，介导cGMP-依赖性蛋白激酶（PKG）的活化作用，增进与递质释放有关的突触囊泡蛋白磷酸化，从而抑制乙酰胆碱或去极化等促进的儿茶酚胺释放。,二、NO与神经系统疾病,（1）脑缺血缺血后eNOS表达增多，具有调节局部血流、改善循环的作用。缺血时nNOS活性增加，与介导缺血早期神经元的坏死有关。,（2）蛛网膜下
19、腔出血蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的发生率高达31.6%-60%。这种脑血管痉挛与血管外膜NOS缺乏、活性降低以及L-精氨酸减少有关。,（3）偏头痛偏头痛的发作过程中存在L-精氨酸/NO/cGMP途径。NO供体硝酸甘油可诱发或加重偏头痛NOS抑制剂L-NMMA可明显减轻偏头痛的发作。,（4）其它与NO相关的神经系统疾病阿尔兹海默病帕金森病癫痫亨廷顿病（亨廷顿病OMIM143100是一种常染色体显性遗传病，其发病率为1/10000。大部分患者发病年龄在二十多岁。典型的亨廷顿病的临床症状有：进行性舞蹈样徐动症，强直，痴呆，通常伴有癫痫。在舞蹈病出现大约十年前患者可表现为精神和行为异常。经X射线衍射可
20、见尾状核特征性的萎缩。本病的分子基础是位于4p16.3的IT15基因编码区多态性位点CAG重复序列增加超过其正常变化范围所致）肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化症、肌病、脑炎、脑脊髓损伤。,三、NO供体的临床应用前景,NO对心血管系统及神经系统的作用，具有广泛的医用价值及开发前景。由于NO在体内半衰期极短，仅数秒钟，一般仅起局部作用；而且，吸入NO给药的途径不方便。故开发有临床实用价值的NO供体，既可作为一种NO体内的运输形式，又可作为一种贮存形式，明显延长半衰期。现已有几类不同结构的NO供体用于临床，在治疗多种疾病中起重要作用。,（一）NO供体药物的分类,NO供体是指具有能释放NO的不同结构的化合
21、物。它们的化学活性取决于相关氮原子的氧化状态，它控制着生理性转化NO（一种+2价的氧化状态）的速率与程度。由于各类NO供体的化学结构和反应各不相同，它们要呈现生物学活性就需要种类各异的酶系统（表9-4）。因此，产生的作用也不尽相同，例如，有机硝酸酯类为选择性降低心脏前负荷的静脉舒张剂，而硝普钠则对动静脉血管的舒张作用相等。该差异可能系血管不同部位酶活性表达不同；或由于体内硝普钠主要为非酶产生NO，因而更易均匀分布而致。,表9-4NO供体药物的分类及特征,表9-4 NO供体药物的分类及特征(续),表9-4 NO供体药物的分类及特征(续),表9-4 NO供体药物的分类及特征(续),a：结构中不含N
22、O，经代谢后末端呈RNN=O,（二）NO供体药物的药理作用及临床应用前景,1.全身血液动力学作用,NO供体用于心血管疾病的治疗已有很长历史。目前硝酸甘油及其他有机硝酸酯类仍在心绞痛治疗占主要地位。各种可供临床使用的NO供体也可用于急性心肌梗塞、急慢性充血性心功能不全及外科血压控制。,（1）心绞痛控制,常用有机硝酸酯类。由于其在低剂量时以降低心脏前负荷占优势，因而选择性降低心室璧张力，缓解心舒期冠脉受压，增加心内膜下血流分布；而对心脏输出量几乎无影响，使其区别于其他NO供体。此外，硝酸酯类还可选择性扩张较大的冠脉交通支，故使血流更易流至心肌缺血区，并增加侧支循环。这种独特的作用可能与局部血管代谢
23、生成NO的差异或辅助因子（巯基）丰富有关。,（2）急性心肌梗塞,不同的NO供体，由于其不同的血管活性，对治疗急性心肌梗塞也有较重要的血流动力学差异。硝酸甘油静脉给药，可获多种益处，如减小梗塞区、改善局部和左室功能、减少重建、降低医院内并发症和住院一年内死亡率。但硝普钠却仅通过降低后负荷而减少心肌耗氧量，故对伴有高血压和心肌缺血的患者可能获益。对血压正常患者，可因降低后负荷而促进冠脉窃流，减少心肌血流，加重心肌梗塞，增加死亡率。,（3）充血性心力衰竭,NO供体如有机硝酸酯类、硝普钠、SIN-1等在充血性心力衰竭中，均有理想的血液动力学效应。所有的NO供体均能降低前负荷；但对心衰时的全身血液动力学
24、情况，取决于外周阻力的相对程度。为了快速达到心衰时平衡前-后负荷的效应，提倡使用硝酸酯类合用动脉扩张剂。疗效最肯定的是硝酸酯盐酸肼屈嗪联合用药，它们既可增强运动耐受力，又可增加左室射血分数。,（4）控制血压,常将硝酸酯类与硝普钠合用，控制全身血压以减少外科手术中血液流失。由于两者作用迅速，半衰期仅2分钟，易于根据血压调节给药量。单用硝普钠降压作用显著，但由于代谢物氰化物有毒性，常合用硝酸酯类，以减小前者剂量，尤其是在冠脉旁路手术中。S-亚硝基巯甲丙脯酸既具备ACEI的降压作用，又同时兼有NO供体的作用，还因其能抑制胃肠道运动与分泌，特别适用于高血压兼患溃疡病患者。,（5）治疗肺动脉高压,NO能
25、扩张肺血管，降低肺动脉压，并抑制由于缺氧促进肺动脉平滑肌增殖。故能减少肺泡死腔，改善肺的通气/血流比值，增加动脉血氧张力。,（6）降低血管成形术后再狭窄风险,血管狭窄处，球囊扩张撕裂的破口处开始痊愈时，造成血管成形术后再狭窄的发生率占30%40%，推测最初的反应就是血管平滑肌的过度增生。由于NO能抑制培养的血管平滑肌细胞增生，降低动物模型动脉损伤初期增厚作用，故应用NO供体可望对此有独特的防治作用。,（7）治疗血栓栓塞性疾病,S亚硝基谷脱苷肽在不影响血压的浓度时，即可显著抑制血小板聚集，因此可望用于某些血栓形成紊乱性疾病。硝普钠既可舒张脑血管，又有抗血小板聚集作用，已有报道颈动脉给药可改善大鼠
26、脑缺血，减小脑皮质梗塞范围，同时伴有脑血流增加和脑电图恢复，有较大的医用前景。,2.拟NANC能神经递质样作用,（1）改善胃肠道平滑肌和括约肌功能,已有关于NO供体用于改善贲门痉挛和胃肠道括约肌功能障碍的报道；对胃酸分泌过度或胃肠运动亢进也可能有积极意义。,（2）改善阳萎病人勃起功能,常用3-morpholinosydnonimine（SIN-1），可全身给回药，0.51 mg/kg/d；或海绵体腔内注射局部给药；用2%硝酸甘油软膏局部外涂，也有一定疗效。由于糖尿病伴阳萎，可能与外周神经退行性改变使精氨酸-NO通路受损有关，因此，NO供体局部用药有较好的指征。另外，有实验初步表明，人参等壮阳药的作用也与增强阴茎海绵体精氨酸-NO信号通路有关。,3.其他,（1）腹膜透析 目前对NO在腹膜透析中的应用和机制研究，尚处起步阶段，结果较难统一。（2）防治或延缓老年性痴呆 NO供体可能具有拟NO样参与大脑记忆形成作用，因此，具有显著脑血管舒张作用的硝普钠，可望其改善脑血流和促进记忆，用于防治和延缓老年性痴呆。,思考题：一氧化氮供体药物对心血管疾病有哪些方面的治疗应用？,
