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1、1,1.生物技术的定义和特点,生物技术的定义利用生物有机体(从微生物直到高等动植物)或其组成部分(包括器官、组织、细胞或细胞器等)发展新产品或新工艺的一种操作技术体系应用自然科学及工程学的原理，依靠生物作用剂的作用将物料进行加工以提供产品或为社会服务 国际经济合作发展组织(1982),2,1.生物技术的定义和特点,生物技术的特点物料可再生资源(碳水化合物、蛋白质等)：价廉物美生物作用剂生物催化剂(酶、细胞)：专一性强、转化率高、条件温和、机理复杂产品或服务涉及多领域 知识与技术交叉多学科,3,1.生物技术的定义和特点,工程,生物,化学,生物技术,生物技术（Biotechnology）多学科示意
2、图,Bioengineering,4,“生物工程”（生化工程）是运用化学工程的原理和方法对实验室所取得的生物技术成果加以开发，使之成为生物反应过程的一门学科。简单地说：是为生物技术服务的化学工程。“生物工程”研究生物反应过程中有普遍性意义的特殊工程技术问题，如大规模细胞培养过程、大规模培养基和空气的灭菌过程、细胞生长和产物形成动力学、生物反应器的优化操作和设计、生物反应过程的参数检测和计算机应用、生化产品的分离纯化等过程中的工程技术问题。由于“生物工程”是化学工程的一个分支学科或被认为是生物学和化学工程相结合的交叉学科而又被称为“生物化工”。,1.生物技术的定义和特点,5,2.生物反应过程的意
3、义和特点,“生物反应过程”实质上是利用生物催化剂以从事生物技术产品的生产过程。当过程采用游离的整体微生物活细胞为生物催化剂时，一般称此为发酵过程（也称微生物培养过程、微生物转化过程等）。当生物催化剂为游离或固定化酶时，此过程则称为酶反应过程。另外，还有动、植物细胞（组织）培养过程。,6,2.生物反应过程的意义和特点,一般生物反应过程示意图,生物催化剂的制备,原材料的预处理,反应器及反应条件的选择,产物的分离纯化,7,生物反应过程具有下列特点：由于采用生物催化剂，反应过程在常温常压下进行，且可运用DNA重组技术及原生质体融合等现代生物技术组建或改造生物催化剂而赋予生物反应过程以现实和潜在的活力，
4、但生物催化剂易于失活，易受环境的影响和杂菌的污染，一般不能长时间使用。以采用可再生资源（renewable resources 碳水化合物、蛋白质等）为主要原材料，来源丰富、价格低廉，过程中废物的危害性较小，但原料成分往往难以控制，给产品质量带来一定影响。,2.生物反应过程的意义和特点,8,与化工生产相比，生产设备较为简单，能量消耗一般也较少，但由于过高的底物或产物浓度常导致酶的抑制或细胞不能耐受如此高的渗透压而失活，因此反应液中的底物（基质）浓度不能过高，因此导致很大的反应器体积且要求在无杂菌污染情况下进行操作。酶反应过程的专一性强，转化率高，但成本较高，发酵过程成本低，应用广，但反应机理复
5、杂，较难控制，反应液中杂质较多，给提取纯化带来团难。,2.生物反应过程的意义和特点,9,4.生物反应过程的生物学与工程学基础,形成了经典的以动力学为基础的工程学概念,生物反应工程：它涉及二方面的内容，即宏观微生物反应动力学和生物反应器工程。其中反应器工程是指包括影响微生物反应宏观动力学的生物反应器形式、结构、操作方式、物料混和传递过程特性等,宏观动力学：但是实际发酵过程是在生物反应器中进行，因此，从实用意义出发，人们重视一定反应器内检测到的反应速率即总反应速率及其影响因素，这就是宏观动力学研究。,动力学与反应器工程,本征动力学：即没有在生物反应器中各种形式的传递过程等工程因素影响时的微生物反应
6、的固有反应速率。,10,4.生物反应过程的生物学与工程学基础,形成了经典的以化学计量学和热力学研究为基础的发酵工程生物学,从工程学角度研究对生长反应的影响。研究各类微生物代谢平衡的理论、方法和实际有效的实验量化数据。例如胞内反应中分解代谢、合成代谢和大分子物质合成之间的物质和能量的关系。,要经过1000多步胞内反应才能转化为代谢产物和细胞成分，我们不可能对这些反应进行一一定量的计算,微生物生长和反应过程研究,必须从基质进入细胞，胞内反应，代谢产物的胞内外分泌等全过程进行分析,11,种子扩大培养将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培
7、养而获得一定数量和质量的纯种。种子扩培的目的获得一定数量和质量的纯种缩短发酵时间、提高设备利用率、保证生产水平,12,种子的要求总量及浓度能满足要求生理状况稳定活力强，移种至发酵后，能够迅速生长无杂菌污染,13,种子制备一般工艺流程,实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此形象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。,生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段种子培养。,14,一般手段有：保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态干燥低温菌种保藏方法：斜面冰箱保藏法（
8、低温）沙土管保藏法（缺营养、低温）石蜡油封存法（缺氧、低温）真空冷冻干燥保藏法（缺营养、缺氧、干燥、低温）液氮超低温保藏法（缺营养、缺氧、干燥、超低温）,2.1.1 种子保藏,15,1）摇瓶液体培养：产孢子能力不强、孢子发芽慢（灰色链霉菌）和不产孢子的菌种（谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母）2）茄子瓶固体培养：产孢子能力强的菌种（产黄青霉菌）3）茄子瓶斜面培养：不产孢子的菌种（细菌）,2.1.2 菌种移接,16,孢子悬浮液：微孔接种法摇瓶菌丝体：火焰保护接种或压差法种子罐之间或发酵罐之间：压差法,2.2.1 菌种移接,17,种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数。发酵级数确定的依据级数受发酵规模
9、、菌体生长特性、接种量的影响级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面,2.2.2 种子罐级数的确定,18,一级种子罐扩大培养（二级发酵）：茄子瓶斜面或摇瓶种子经过一次种子罐扩大培养，接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养。,2.2.2 种子罐级数的确定,19,二级种子罐扩大培养（三级发酵）：茄子瓶斜面或摇瓶种子经过两次种子罐扩大培养，接入发酵罐作为种子，这称为二级种子罐扩大培养。三级种子罐扩大培养（四级发酵）：一级发酵：孢子或菌丝体直接接入罐中发酵，称一级发酵。,2.2.2 种子罐级数的确定,20,接种龄：指种子罐中培
10、养的菌体，移入下一级种子罐或发酵罐之前在原种子罐中的培养时间。通常接种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对 数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高 峰时为好。种子过于年轻会出现：（1）前期生长缓慢（2）整个发酵周期延长（3）产物开始形成时间晚。种子过于衰老：引起菌丝过早自溶，生产能力下降。,2.2.3 接种龄与接种量,21,接种量：是指移入的种子液体积（V1）和接种后培养液体积（V1+V2）的比例（V1/V1+V2）。一般接种量：515过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。接种量较大：接种量过多：接种量过少：获得高产的其它措施：双种法：两个种子罐接种到一个发
11、酵罐中。倒种法：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。,2.2.3 接种龄与接种量,22,生产中通常测定的参数：,pH值；磷、糖及氨基氮的含量；菌丝形态、菌丝浓度、培养液外观（色素、颗粒等）；其它如酶活等；,2.2.4 种子质量判断,23,2.3.1 原材料质量质量波动：1）产地、品种、加工方法及用量；2）无机离子含量不同（起主要作用）；2.3.2 培养条件1）温度2）湿度3）通气量斜面冷藏时间,2.3 影响种子质量的因素,24,2.4 种子质量控制措施,种子质量的最终指标：考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。1）保证生产菌种的稳定性 检查稳定性方法：,25,2）保证无杂菌侵入通常方法
12、：种子液显微镜观察 种子液 琼脂斜面：无菌试验生化分析：营养消耗速度、pH变化、溶氧利用、色泽气味等,26,培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。,发酵培养基的作用：,满足菌体的生长 促进产物的形成,27,发酵培养基的要求,培养基能够满足产物最经济的合成。发酵后所形成的副产物尽可能的少。培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。,28,第二节 发酵培养基的
13、成分及来源,一、碳源,1、作用,提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源合成菌体所必需的碳成分提供合成目的产物所必须的碳成分,2、来源,糖类、油脂、有机酸、正烷烃,29,3、工业上常用的糖类,葡萄糖,几乎所有的微生物都能利用葡萄糖 但是会引起葡萄糖效应,工业上常用淀粉水解糖，但是糖液必须达到一定的质量指标,糖蜜,糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。,糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜、葡萄糖蜜。,30,糖蜜使用的注意点：,除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。,例：谷氨酸发酵,有害物资：胶体成分（
14、起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）,预处理：澄清脱钙脱除生物素,例：柠檬酸发酵,有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）,预处理：黄血盐,31,淀粉、糊精,使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类,缺点：难利用、发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。,优点：来源广泛、价格低、可以解除葡萄糖效应,32,二、氮源,氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。,1、无机氮源,种类：氨盐、硝酸盐和氨水,特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源
15、的迅速利用常会引起pH的变化如：(NH4)2SO4 2NH3+2H2SO4 NaNO3+4H2 NH3+2H2O+NaOH,33,无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。,所以选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的pH,34,2、有机氮源,来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋
16、白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。,成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。,例 玉米浆：可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 较多的乳酸 硫、磷、微量元素等,35,有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响。,36,氮源使用的一些相关问题：,有机氮源和无机氮源应当混合使用,早期：容易利用易同化的氮源无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质,有些产物会受氮源的诱导和阻遏,例：蛋白酶的生产,有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力,开发效
17、果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣 的课题,37,三、无机盐及微量元素,1、作用：各种不一样,2、来源：C、N源，以盐的形式补充,3、用量：根据具体的产品，以实验决定，P104,4、使用注意点,A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑,例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml 发酵罐必须进行表面处理,38,B、使用时注意盐的形式（pH的变化）,例：黑曲酶NRRL-330,生产-淀粉酶，P对酶活的影响 pH 酶活不加 4.25 120分钟加 K2HPO4 5.45 30分钟加 KH2PO4 4.62 75分钟,39,四、生长因子、前
18、体和产物促进剂,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。,1、生长因子,如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。,有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B族维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子,40,前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。,2、前体,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,41,作用：前体有助于提高产量和
19、组份 P107,用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化 率的问题,例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸 青霉素6000*0.6（微克）36mg/ml 苯乙酸（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在46-90%之间 例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）转化率为：0.6/(0.337*36/13.8)=68%,42,用法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧 化，流加也有利于提高前体的转化率,43,3、产物促进
20、剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,44,五、水,对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。,水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。,对于酿造行业，水的重要性不言而喻,对于常规发酵，
21、可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。,45,第三节 发酵培养基的设计和优化,一、培养基成分选择的原则,菌种的同化能力,代谢的阻遏和诱导,合适的C、N比,1000.22.0,pH的要求,46,（一）、理论转化率与实际转化率,理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。,实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小,如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个目标,二、成分含量的确定,47,例:如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算如下 葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为 C6H12O6 2C2H5OH+2CO2 葡萄糖转化为酒精的理论得率为 2*4
22、6 Y=0.57 162,48,四、摇瓶水平到反应器水平的优化配方,摇瓶、反应器培养基研究的两个层次,摇瓶培养基设计的第一步,反应器最终的优化的基础配方,49,灭菌,在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作，而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提,有时避免营养物质在加热的条件下，相互作用，可以将营养物质分开消毒。,有些物质由于挥发和对热非常敏感，就不能采用湿热的灭菌方法,Na2HPO4+CaCO3CaHPO4+Na2CO3,50,第四章 灭菌(sterilization),4.1 灭菌的意义和方法 意义灭菌：指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中所有杂菌的过程。杂菌：除生产菌以外的所
23、有有生命的物质。生产菌：用于生产人们所需物质的微生物。染菌：若生产菌在培养过程中污染了杂菌，称染菌。,51,染菌的危害：,1）消耗培养基的营养成分；2）杂菌分泌对生产菌有害的物质或使代谢产物分解；3）杂菌的代谢物会改变环境的pH值，抑制生产菌的生 长和代谢物的合成；4）影响发酵液的过滤、提炼和精制，影响产品的质量 和收率；5）发酵染菌不但影响个别罐的生产，还会引起连续大 幅度的染菌，给生产带来极大威胁。意义：保持纯种培养以确保得到所需产物。,52,灭菌的方法,用甲醛、苯酚、cl2、酒精、K4 mn o4、Hgcl及新洁尔灭等药剂进行灭菌,化学法,化学药剂灭菌,化学药剂与细胞发生化学反应，从而起
24、到消毒和防腐作用,实验室器皿、工具或生产用水（很少用于培养基灭菌：因为一些培养基成分也会与其反应且不易去除）,物理法,热灭菌,干热,湿热,160干热空气或压缩空气所产生的热维持1小时,微生物由于氧化作用而死亡，高温时微生物体内各种与温度有关的氧化反应加快（Q10=2-3），导致死亡,要求灭菌后保持干燥状态的物质（如容器等）,常用120 饱和蒸汽维持20-30min,蒸汽冷凝时释放出大量潜热并且有很强的穿透性（在高温且有水分存在下微生物细胞中蛋白质极易凝固而引起微生物死亡）,广泛用于工业培养基和设备灭菌-经济、快速（当直接通入蒸汽灭菌，配制培养基时注意扣除冷凝水的体积）,介质过滤除菌,常用棉花、
25、活性碳或超滤膜等过滤介质,利用过滤介质捕集流体（空气、液体）中的灰尘和杂菌,广泛用于好氧培养中的空气除菌（及产品提取中无菌过滤）,辐射灭菌,利用紫外线高能量的热磁波（如及射线）的辐射,一定波长的射线对微生物的杀灭作用,因其穿透力低，只能用于表面灭菌（如无菌室内空气的灭菌，射线特别用于食品工业）,53,除菌：用物理方法除去流体中杂质的操作。消毒（disinfection）：用物理或化学方法杀灭病原菌的操作。灭菌（sterilization）：用物理或化学方法杀灭物料中所有有生命的物质。,54,4.2 微生物的热死动力学,4.2.1 微生物的热阻1)微生物对温度的适应性类别 最低限温度 最适生长温
26、度 最高限温度 致死温度 致死时间嗜冷菌 0 1020 30 常温菌 5 2040 50 无芽孢60 10mim 有芽孢100几分钟几小时嗜热菌 30 5060 90 120 2030min致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下，杀灭全部微生物所需的时间。在致死温度以上，致 死温度愈高，致死时间愈短。,55,2)微生物抗热能力的度量热阻：在特定条件下（主要是温度和加热方式），微生物的致死时间称为热阻。相对热阻：在特定条件下，微生物1的致死时间与微生物2的致死时间之比。3)灭菌程度的度量 灭菌度:N0/N 残存率:N/N0，N0、N灭菌前后微生 物（杂菌）含量4)灭菌准则：以杀灭
27、芽孢细菌的程度为标准。,56,对数残留定律微生物热死的规律,1)数学表达式,式中 t：灭菌时间 N：微生物存活数-dN/dt：表示某一瞬间微生物的变化量“”：表示微生物随灭菌时间的延长而减少 k：微生物死亡速度常数 k=f（微生物、温度、加热方式）,57,边界条件：N|t=0=N0(灭菌始态原有菌数)N|t=t=Ne（灭菌终态残留菌数）积分上式得 以 t 作图 斜率为 k 十进制衰减时间：当N0/Ne=10时，D=2.303/k,58,Ne的确定：Ne0，t=，没有意义；Ne0.5，意味着两次灭菌可能有一次染菌；一般工业上设：Ne10-3，意味着1000次灭菌可能有一次染菌。,59,相继死亡模
28、型：（此章节内容不做考试要求）,抗热芽孢 热敏芽孢 死亡芽孢（个/ml）KR、Ks 死亡速度常数（min-1）比失活速率,动力学方程 dNR/dt=KR NR-+dNS/dt=KR NR KS NS-,60,由积分：,得：（NR/N0）=KRt NR=N0e-KRt=N0exp(-KRt),代入得:(dNs/dt)=KR N0exp(-KRt)KSNS 即：(dNs/dt)+KSNS=KR N0exp(-KRt)-一阶非齐次常微分方程,形如：y+p(x)y=Q(x)通解：y=e-p(x)dx Q(x)e p(x)dx dx+c,61,得:NS=e-Ksdt KRN0exp(-KRt)eKsdt
29、 dt+c=e-Kst KRN0exp(-KRt)eKst dt+c=e-Kst KRN0 e(Ks KR)t dt+c=e-Kst(N0KR/(Ks-KR)e(Ks-KR)t+c,由Ns|t=0=0得：c=-1,则：NS/N0=(KR/(Ks-KR)e(Ks-KR)t-Kst-e-Kst=(KR/(Ks-KR)e-KR t-e-Kst,62,Ne/N0=(NR+NS)/N0=e-KR t+(KR/(Ks-KR)e-KR t-e-Kst=e-KR t(Ks-KR+KR)/(Ks-KR)-e-Kst KR/(Ks-KR)=e-KR t Ks/(Ks-KR)-e-Kst KR/(Ks-KR)当Ks
30、 KR Ne/N0=e-KR t,63,4.2.3 k的求取及温度对k的影响,1)k的求取,2)温度对k的影响阿累尼乌斯定律:k=Aexp(-E/RT)A：频率因子(min-1)T：绝对温度(K)E：微生物热死活化能（J/mol 或 cal/mol）R：气体常数(8.314J/mol*K或1.987 cal/mol*K),64,3)E的求取,lnk=lnA-E/RT 以lnk1/T作图 E=-R*斜率 E(kcal/mol)Q10 有芽孢微生物细胞 100 35 微生物营养细胞 5060 510 化学分解反应 220 1.52 活化能越高，k对温度越敏感，温度对k的影响越大。,65,培养基灭菌
31、最佳操作条件的选择,1)培养基营养成分分解动力学 dc/dt=-kc式中 c：营养成分的浓度（mol/升）t：反应时间（秒）k：营养成分分解速度常数（秒-1）k=f(T,反应类型)2)k与T关系k=Aexp(-E/RT)一般 EE,66,3）培养基灭菌最佳操作条件的选择设灭菌温度由T1升至T2，对于微生物死亡而言：,（2）（1）得：,67,同理对于营养成分的破坏而言有：,（3）/（4）得：,因为EE 所以:,68,讨论：1）T升高，k(k)也升高，但k升高的幅度大于k 升高的幅度，这对灭菌有利（无菌培养的基础）；2）T升高，k升高，如灭菌度一定，t减少；因此，培养基灭菌最佳操作条件高温快速。,
32、温度对VB1破坏的影响灭菌温度(）100110120130140150N/N0=10-16时所需时间（min）843757.60.8510.1070.105VB1损失（%）99.9989271031 由此表求E、A、E、A,69,影响培养基灭菌的因素,1)培养基中杂菌的种类和数量耐热菌 k小 Ne/N0一定 t大 N0大 Ne和k一定 t大t大可能的后果：c/c0小；有可能产生妨碍微生物生长和代谢的产物。,70,2）培养基的pH值pH 68时，微生物耐热性最强；pH6时，H+易渗入微生物细胞，改变细胞的生理状态促进其死亡因此，pH降低，t减少。,71,3）培养基成份高浓度的糖类、油脂及蛋白质
33、耐热性 t高浓度的有机物 培养基粘度 传热效果 t高浓度的盐类 细胞渗透压 传热 t培养基中的颗粒物质 传热 t 4）泡沫5）其它：是否饱和蒸汽、空气排除、菌龄、搅拌,72,分批灭菌的设备及计算,1)分批灭菌设备：发酵罐、进出蒸汽管道2)分批灭菌的全过程三个阶段：a.预热升温：目的：避免料液与蒸汽温差太大，产生小泡撞击声；对培养基固体颗粒起糊化作用。b.保温：维持118120，0.91.0kg/cm2，30min冷却：完成整个灭菌周期35小时,73,3)分批灭菌计算,N0,N1,Ne,N2,74,各阶段灭菌贡献分别为：升0.2总 保0.75总 冷0.05总,灭菌所需时间 t总=t升+t保+t冷
34、 总升保冷,75,升温阶段k值计算：,k平均求解：图解积分法辛普生积分法,76,升温结束时的残菌数,保温时间,77,4.3.2.2 连续灭菌的优缺点,优点营养物质破坏少，有利于提高代谢产物产率；发酵罐利用率提高；过程限制容易，便于自控；系统避免反复加热冷却，提高热能利用率。缺点不适于含有颗粒或糖度大的培养基；需额外投资灭菌上设备；需较稳定的压强，不低于4kg/cm2（表压）的蒸汽。,78,典型流型：活塞流 滞流 湍流=umax=0.5 umax=0.82 umax 培养基受热时间相同 培养基受热时间不同 存在停留时间分布 分析问题：对于存在停留时间分布的培养基，其灭菌保温时间不能直接用对数残留
35、定律计算。解决问题：介绍一种公式化的模型轴向扩散模型。,79,2)返混（back mixing）与停留时间分布（resident time distribution）返混：不同瞬间进入容器的物料质点之间的混合。返混原因：分子扩散、涡流返混与RTD关系：前因后果注意点：活塞流不存在返混，pe；全混流返混程度最大，pe 0；返混与RTD是因果关系，RTD反映了返混的程度，但不同的返混可能存在着同一RTD；返混是流体连续流动的宏观参数，任何连续流动过程都必须考虑之，分批过程不存在返混；一般返混将导致设备利用能力降低，但对于连续发酵、自催化而言，返混则有利。,80,3）轴向扩散模型流动活塞流轴向扩散在
36、一根截面积为A（米2）的长管中，任取一长度为dx（米）的微元，含有杂菌浓度为N（个/m3）的培养基以平均流速（m/h）的速度等温连续流过微元，培养基流体存在返混，其轴向混合扩散系数为Ez（m2/h），流体流动达到稳定时，对dx小段可作如下的微生物物料衡算：,81,对dx小段可如下的微生物物料衡算单位时间内按活塞流流入微元的芽孢数:(1)式单位时间内按活塞流流出微元的芽孢数:(2)式,82,单位时间内因返混离开微元的芽孢数：（3）式单位时间内因返混进入微元的芽孢数：（4）式,83,单位时间内在微元中杀灭的芽孢数:（5）式就微元中的芽孢作物料衡算：即(1)-(2)+(4)-(3)=(5)得：,84
37、,则上式为（1）对此式进行无因次化 设得,85,代入（1）得令 Pe=UL/Ez（Peclet 准数表征通混的程度Pe=0全混 Pe-无穷 活塞流）N=Lk/U(反应准数 Reaction Number),86,则（2）式可写成：二阶齐次常微分方程组设 代入（3）得：,87,即,88,即通解,89,90,左式代入右式：得：,91,92,5.1 微生物对氧的需求及影响因素,5.1.1 微生物对氧的需求氧的作用：1)作为呼吸链电子传递系统的最终电子受体。2H+2e-+1/2O2 Cyta3 H2ONADH FMN CoQ Cyt b Cyt c Cyt aa3 O2 H+电子传递部位 线粒体膜壁真
38、核微生物（高等原生生物）质膜 原核微生物（低等原生生物）2)直接参与一些生物反应。,93,决定氧消耗速率的因素：1)线粒体上的酶活力。2)底物种类与浓度 3)溶解氧浓度表征氧消耗速率的物理量 呼吸强度（比耗氧速率）：mmol/g(dry cell)*h 摄氧率：mmol/l*h 的关系：x:g(dry cell)/l CL 关系：CLC临 恒定 一般C临 0.0030.05 mmol/l，氧饱和浓度的125。在发酵过程中，氧不需达到饱和浓度，CL C临即可，细胞呼吸不受抑制。,94,CL的关系（溶解氧为限制性底物）：其中：最大比生长速度（1/h）K0：某一系统饱和常数 与K0求取：与 的关系：
39、=K(合成产物和维持代谢的呼吸忽略时)与CL的关系：m：微生物最大呼吸强度，通常可当作微生物固有的对O2的需求值。讨论：满足双曲线形式 当CL K0，恒值。,95,1）培养基（成份、浓度）补料增加矿物质浓度 2）菌种与菌龄 不同菌种有不同的、同一菌种年轻菌丝3）菌体浓度 菌体浓度 注意：与代谢产物形成之间没有固定关系,影响微生物需氧量的因素,96,4）培养条件：T m5）其它因素有毒代谢产物的形成积累；NH3、CO2等不能及时排出 影响生长挥发性中间产物的损失；动植物油等消泡剂被利用。,97,5.2 培养过程中氧的传递,氧在液体中的溶解特性：1）温度 T 溶解性2）溶液性质：不同溶液（在相同温
40、度、气体分压）不同溶解度；水 1atm 25 溶解度 0.26mmol/l 发酵液 1atm 25 溶解度 0.20mmol/l 同一溶液 溶质浓度 溶解度 3）氧的分压：,98,99,5.2.2 氧传递的各项阻力,100,传递过程：14供氧方面的阻力，59耗氧方面的阻力；传递阻力及其表示：传递系数(m/s)游离细胞：=0;细胞吸附在气液界面：=0;、较小，与细胞外径平方成正比；搅拌、工艺条件合理，结团现象少，较小；生长条件合适、代谢产物及时排出，较小。,101,总阻力R=1/k1+1/k2+1/k9传递动力及其表示：或氧传递速率（稳态）：NA=总推动力/总阻力（mol/m2*s）,102,假
41、设：把气液相视作两个静止的膜：气膜、液膜。视膜内传递为分子扩散过程。界面上气液两相呈平衡状态，服从亨利定律。气相到液相的传质过程视作稳定串联过程（膜上无积累、一维扩散）。,103,方程的建立：1）单位界面积上气相组分A的传递速率方程式：NA=(mol/m2*s)：气液膜传质系数；：界面上组分A气体分压与液体浓度；P CL：气相主体组分A分压 与液相主体组分A的浓度,104,、难测定，NA=(mol/m2*s)式中，KL：以浓度差表示推动力的总传质系数；KG：以氧分压差表示推动力的总传质系数；P*：与液相中CL成平衡时的气相分压；C*：与气相中P成平衡时的液相中溶解氧浓度（饱和浓度）。,105,
42、KG KL与kg kl的关系：,106,同理：,107,由于 H1，,108,2）单位体积氧传递速率(OTR)方程式,a:单位体积液体中所含的气液接触面积（m2/m3）:体积氧传递系数、供氧系数，表征通气搅拌效果及通气效率(1/h)。双模理论的研究和建立已有长久的历史，从理论到解决工程问题都较为成熟，因而目前仍被认为是工程上解决传氧问题的基本理论和方法。单位体积氧传递速率(OTR)方程式,(mol/m2*s),(mol/m3*s),单位界面积上气相组分A的传递速率方程式,单位体积氧传递速率(OTR)方程式,109,5.2.4 发酵液中溶解氧浓度的变化规律,=传氧速率耗氧速率(mol/m3*s)
43、讨论：0，通气良好；0，缺氧；=0，稳态，此时，当 0,110,预防措施：移出部分发酵液，加入新鲜培养基；直接补充无菌水。,111,5.3 影响传氧的因素,5.3.1 影响供氧系数的因素影响因素：搅拌（P）、空气流速（Vs）、发酵液粘度（）、空气分布器型式、发酵液高度、搅拌浆形式等.1）搅拌作用分散气泡，减少气泡直径，a；减少菌丝结团，细胞外液膜阻力减少，细胞周围废气、废物浓度降低，细胞对氧气和营养吸收增加；,112,涡流延长气泡在液体中的停留时间湍流 k3 k4增加，提高。搅拌功率过大，剪切作用大，细胞损伤，动植物细胞尤为敏感；产生大量搅拌热，加重传热负担；2）Vs 0.40.72 有机械搅
44、拌，搅拌器形式；0.330.82 无机械搅拌，空气分布器形式；0 Vs过载速度，搅拌器无法分散空气，空转。,113,3）培养液的物性：密度、粘度、表面活性剂、离子强度的变化影响 菌体浓度、气体溶解性、稳定性及液体流动性。4）空气分布器及发酵液高度5.3.2 影响氧传递动力的因素（）1）培养温度 T 大 C*小；2）发酵液组成对C*的影响水电解质溶液,114,电解质混合液非电解质溶液或有机物电解质非电解质溶液3）氧分压提高 罐压升高 通入纯氧 降低培养温度,115,变化的规律：接种前 饱和浓度的100；接种后 降低；对数期 大大降低；对数期后 略升；补料 降低；后期 上升；染好氧菌 下降。,11
45、6,5.4 KLa的测定,5.4.1 冷膜法（不存在微生物情况下）1）,117,测定 一系列数据，作 图，斜率1/kLa。2）ts：容器中溶液被氧饱和时间。3）测定：通氮气、通空气、利用溶氧电极测 数据。,118,t,119,曲线：溶氧饱和度曲线,I,120,1,返回,121,4）溶氧电极滞后带来的偏差的校正阶跃相应曲线：校正：5.4.2 直接测定法或物料衡算法（存在微生物)当溶解氧浓度的变化达到稳态时，(1/h)1)r求取：用氧气分析仪在正常发酵过程中测定发酵罐进气、出气口气体中的氧气量而得。,122,PV=nRT n=PV/RT：体积氧传递速率（mol/l*h）y:氧气分压（mol(O2)
46、/mol(air)）,123,发酵罐进口空气中氧传递速率：发酵罐出口空气中氧传递速率：,124,物料衡算：no2(mol/lh)Q=V/t Q(l/min)VL(l)T(k)P(atm)R=0.082 r(mmol/lh)若P1=P2=1atm Q1=Q2=G T1=T2=273.15k,125,2)C*求取：小型发酵罐（可理想混合）：C*C*2（排气中氧分压平衡的氧浓度），则大型发酵罐：（一般不能获得理想混合）,126,5.4.3 动态测定法（快速响应复膜氧电极）5.4.4 化学模拟法（亚硫酸钠氧化法）Na2SO3+O2 2Na2SO4特点：（1）反应速度不受Na2SO3浓度影响（2）CL=0,127,2Na2SO3+O2 2Na2SO4nO2测定：通气、搅拌，取不同时间样品与I-KI作用Na2SO3+I2 Na2SO4+2HI多余I2用标定过Na2S3O3滴定2Na2S2O3+I2 Na2S4O6+2NaI4Na2S2O31O2N:Na2S2O3溶液的毫克当量浓度 t:时间（h）Vs:试样体积(ml)V0:开始通气时样品用Na2S2O3溶液滴定时的用量(ml)；Vt:t时样品用Na2S2O3溶液滴定时的用量(ml),128,129,优点：经典利用氧的传递特性方法简便、可靠缺点：非实际发酵过程测试工作需要大量的手工操作对于大型发酵罐，用此法估算kLa的材料费用较高。,
