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1、环境生物工程,李福利,环境生物工程,环境中主要污染物生物净化与生物废料再生微生物与环保石油污染的生物治理耐热微生物生物脱硫研究,环境基本概念,在环境科学领域，环境的含义是：以人类社会为主体的外部世界的总体。按照这一定义，环境包括了已经为人类所认识的，直接或间接影响人类生存和发展的物理世界的所有事物。它既包括未经人类改造过的众多自然要素，也包括经过人类改造过和创造出的事物。需要特别指出的是，随着人类社会的发展，环境的概念也在变化。以前人们往往把环境仅仅看作单个物理要素的简单组合，而忽视了它们之间的相互作用关系。进入七十年代以来，人类对环境的认识发生了一次飞跃，人类开始认识到地球的生命支持系统中的
2、各个组分和各种反应过程之间的相互关系。对一个方面有利的行动，可能会给其他方面引起意想不到的损害。,主 要 环 境 污 染 物 简 介一、空气主要污染物,1.二氧化硫(SO2)二氧化硫主要由燃煤及燃料油等含硫物质燃烧产生。二氧化硫对人体的结膜和上呼吸道粘膜有强烈刺激性另外，二氧化硫对 金属材料、房屋建筑、棉纺化纤织品、皮革纸张等制品容易引起腐蚀，剥落、褪色而损坏。还可使植物叶片变黄甚至枯死。2.氮氧化物(NOx)NOx污染主要来源于生产、生活中 所用的煤、石油等燃料燃烧的产物(包括汽车及一切内燃机燃烧排放 的NOx)；其次是来自生产或使用硝酸的工厂排放的尾气。当NOx与碳 氢化物共存于空气中时，
3、经阳光紫外线照射，发生光化学反应，产生 一种光化学烟雾，它是一种有毒性的二次污染物。3.粒子状污染物 空气中的粒子状污染物数量大、成分复杂，它本身可以是有毒物 质或是其它污染物的运载体。煤烟、工业生产过程中产生的粉尘、建筑和交通扬尘、风 的扬尘等，以及气态污染物经过物理化学反应形成的盐类颗粒物。,4.酸雨 指降水的pH值低于5.6时，降水即为酸雨。降水酸度pH4.9时，将 会对森林、农作物和材料产生明显损害。5.一氧化碳（CO）6.氟化物（F）指以气态与颗粒态形成存在的无机氟化物。氟化物对眼睛及 呼吸器官有强烈刺激，吸入高浓度的氟化物气体时，可引起肺水肿和 支气管炎。7.铅及其化合物（Pb）指
4、存在于总悬浮颗粒物中的铅及其化合物。主要来源于汽车排出 的废气。铅进入人体，可大部分蓄积于人的骨骼中，损害骨骼造血系 统和神经系统，对男性的生殖腺也有一定的损害。引起临床症状为贫 血、末梢神经炎，出现运动和感觉异常。我国尿铅80微克/升为正常 值，血铅正常值小于50微克/毫升。,二、地面水主要污染物,1.氨氮 指以氨或铵离子形式存在的化合氨。氨氮主要来源于人和动物的 排泄物，生活污水中平均含氮量每人每年可达2.54.5公斤。氨氮是水体中的营养素，可导致水富营养化现象产生，是水体中 的主要耗氧污染物，对鱼类及某些水生生物有毒害。2.石油类 主要来源于石油的开采、炼制、储运、使用和加工过程。石油类
5、 污染对水质和水生生物有相当大的危害。漂浮在水面上的油类可迅速 扩散，形成油膜，阻碍水面与空气接触，使水中溶解氧减少。油类含 有多环芳烃致癌物质，可经水生生物富集后危害人体健康。3.化学耗氧量（COD）是指化学氧化剂氧化水中有机污染物时所需氧量。水中有机污染物主要来源于生活污水 或工业废水的排放、动植物腐烂分解后流入水体产生的。水体中有机 物含量过高可降低水中溶解氧的含量，当水中溶解氧消耗殆尽时，水 质则腐败变臭，导致水生生物缺氧，以至死亡。,二、地面水主要污染物,4.生化需氧量(BOD5)生化需氧量也是水质有机污染综合指标之一，是指在一定温度(20)时，微生物作用下氧化分解所需的氧量。其来源
6、、危害同化学 需氧量。5.挥发酚 水体中的酚类化合物主要来源于含酚废水酚类属有毒污染物，但其毒性较低。酚类化合物对鱼类有毒害作 用，鱼肉中带有煤油味就是受酚污染的结果。6.汞 汞（Hg）及其化合物属于剧毒物质，可在体内蓄积。水体中汞对人体的危害主要表现为头痛、头晕、肢体麻木和疼痛 等。总汞中的甲基汞在人体内极易被肝和肾吸收，其中只有15%被脑 吸收，但首先受损是脑组织，并且难以治疗，往往促使死亡或遗患终 生。7.氰化物 氰化物具有剧毒。氰化氢对人的致死量平均为50微克；氰化钠约 100微克；氰化钾约120微克。氰化物经口、呼吸道或皮肤进入人体，极易被人体吸收。急性中毒症状表现为呼吸困难、痉挛、
7、呼吸衰竭，导致死亡。,三、噪声,从物理定义而言，振幅和频率上完全无规律的震荡称之为噪声。从环境保护角度而论，凡是人们所不需要的声音统称为噪声。噪声的 显著特点是：无污染物存在、不产生能量积累、时间有限、传播不远、振动源停止振动噪声消失、不能集中治理。噪声来源于交通工具、工 厂机器设备、建筑施工和人们的社会、家庭活动。噪声对人类的危害个是多方面的，其主要表现为对听力的损伤、睡眠干扰、人体的生理和心理影响。当人在100分贝左右噪声环境中 工作时会感到刺耳、难受，甚至引起暂时性耳聋。超过140分贝的噪 声会引起眼球的振动、视觉模糊，呼吸、脉膊、血压都会发生波动，甚至会使全身血管收缩，供血减少，说话能
8、力受到影响。,生物净化与生物废料再生,几个世纪来，人们相信有大气、土壤和水体等组成的自然系统足以吸收人类的生活以及工农业生产所产生的各种废物；这种想法在工业还不发达、人口密度不大的时代和地区还有些道理，但在工业高度发达、人口密度日益增高的今天，这种看法就明显落后了；当代，世界各国也都寻求通过立法来解决环境污染的问题，即消除、最循环、再生（Remove，Recycle、Regeneration）。,生物净化与生物废料再生,生物净化是指利用生物来除去环境中的生物垃圾和有毒物质的过程。生物垃圾包括工农业生产过程中所产生的废弃物，现在人们普遍认为，生物垃圾是制造许多有经济价值的产品的原材料。在今天人口
9、膨胀、食品及能源资源不足的情况下，对资源的充分再利用就更显得意义重大，目前这一问题已经引起了世界各国的充分重视。,环境的污染,莫斯科 1993年 格德.鲁德威1973年以后在莫斯科工业区附近，已经出生了90名四肢不全的畸形儿。(国家地理杂志),美国密歇根州铜矿及工厂产生的尾料将湖水染红,战争的污染可怜的伊拉克,(from 国家地理杂志),酸雨的危害,美国纽约州，阿第伦达克山 1980年 泰德.史匹格尔早春时节的酸雨酸雪污染了河川，造成一场致命的“酸流”，令溪鳟纷纷死于鳃部伤害。(国家地理杂志),现代生物技术在降解非生物物质中的应用,环视四周，有毒废弃物给人们所造成的环境问题是触目惊心的：据统计
10、，仅在1985一年中，全世界所产生的有毒废弃物五氯苯（PCP）就达到50000吨；目前，全世界投入生产的化学物质有500多万种，而且这个数字还在以每年数千种的速度不断上升。,现代生物技术在降解非生物物质中的应用,过去，人们通常采用焚烧和化学处理这两种方法来处理这些有毒废弃物，遗憾的是这些方法成本较高，而且会产生新的污染物质。,现代生物技术在降解非生物物质中的应用,到20世纪60年代中期，人们发现一些土壤微生物可以降解非生物物质，例如除草剂、杀虫剂、制冷剂等。人们可以通过利用微生物的方法来清除有毒废弃物，这种通过微生物降解废物的方法为人类提供了一种安全有效的方法，且成本低廉。,生物降解途径的基因
11、工程,转移质粒：某一菌株常常局限于分解免疫种化合物，但在废弃物中通常含有多种化学物质，因此，很有必要扩展某一特定菌株的分解范围。最简单的方法是通过结合作用把编码不同降解途径的酶的基因导入同一受体菌中。如果两种质粒具有同源性，那么他们可能会重组成为一个大的、具有多种功能的融合质粒。,生物降解途径的基因工程,Chakrabarty等人在20世纪70年代首先构建成功了含有多种降解功能的细菌菌株。他们使用不同的质粒来构建能分解石油中的一系列碳氢化合物的菌株，该菌株被称为“Superbug”，因为它的代谢能力远远高于其它菌株。,生物降解途径的基因工程,具体实验如下：通过结合作用，pCAM质粒(具有降解莰
12、酮功能)被转入含有pOCT质粒（具有辛烷降解能力）的菌株中，但这两种质粒是不相容的，不能作为两个独立的质粒而共存于同一个细胞中。经过重组，这两种质粒形成了一个较小的，同时具有pCAM 和pOCT的降解功能的单一质粒。通过接合作用将带有pNAH的质粒（具有萘降解功能）转入含pXYL质粒（具有降解二甲苯功能）的菌株中。pNAH质粒于pXYL质粒是相容质粒，可在同一宿主菌中共存。然后将pCAM/OCT融合质粒转入pNAH与pXYL质粒共存的菌株中，这种新的重组菌株在原油中比含有单一质粒或两种质粒的菌株能够更好的生长。,微生物与环保,我们大家谁也不愿意生活在一个充满污染的环境之中，然而，环境污染却有日
13、益加剧的趋势。,微生物与环保,这一方面是源于工业和现代文明的发达；一方面也由于人类尚缺乏环保意识和治理环境污染的有效方法。,全球商业性捕鱼简史1900年与1995年之比较,微生物与环保,海上石油泄漏事件时有发生；包含着众多有害物质的污水大量倾入江河湖海；工厂的黑烟的遮住了美丽的天空；由难以分解的一次性塑料袋造成的白色污染总是令人不安,微生物与环保,所有这一切，依靠工业及其相关技术是难以解决的，而现代生物技术在环境保护方面却可以发挥它的“奇效”。,微生物与环保,前面我们已经谈到过，微生物本领很大。形形色色的微生物构成的微生物大军已经形成了在人类生产生活的各个领域皆能大出风头的“全能选手”。在环境
14、保护领域也不例外。,微生物与环保,微生物的生存空间十分广阔，到处都有这些小家伙寄生的踪迹。十分有意义的是，微生物通过自身的代谢活动，可以改变其赖以寄生的各种物质的化学性质，比如说把纤维物质转化为汽油、沼气等。在种类繁多的微生物中也不难找到可以用来清除污水、污物中有害物质的种类，利用它们对这些有机、无机的污染物质的吸收转化功能，对环境保护将起到积极的作用。,微生物与环保,然而，要有效地清除环境污染，单纯依靠天然微生物资源是远远不够的。科学家们依靠基因工程、细胞融合等高超技术，不仅对现有微生物种类进行反复的筛选和改造，而且重新组建了一批清除污染的“尖兵”。具有特殊功能“工程菌”、“超级菌”，能够高
15、效率地分解有机污染物，从而将应用生物技术消除环境污染提高到了一个崭新的水平。,微生物与环保,近些年来，能够消除海面上石油污染的“石油菌”，能够分解毒性很强的金属汞化物的新型耐汞细菌，甚至能够把毒性很强的有机物，如酚类、氰类等分解利用的生物工程菌纷纷应运而生，显示出了微生物在治环境污染方面的潜在应用价值。比如，科学家们将能降解石油的几种基因，结合转移到一株假单孢菌中，构建成了能够降解多种原油成分的“超级微生物”。在油田、炼油厂、油轮以及被石油污染了海洋、陆地，它都可以发挥去除石油污染的效力。,微生物与环保,选用能够降解污染物的微生物，采用生物技术将它们富集起来，再将这些微生物固定在生物膜上，做成
16、生物反应器，安装在废水处理池中，就可能达到净化污水的作用。日本的科学家则研制成了新型的有机废弃物处理装置，它是一种高速发酵处理装置，利用发酵促进剂在小时之内就可以使废弃物分解发酵，然后再采用烘干法进行处理，以达到清除污染物的目的。,微生物与环保,上面我们讲了微生物可以用来清除地上的污染。那么，能不能利用微生物来净化空气呢？能！早在年，美国人就获得了“利用微生物处理废气”的专利。国外在这方面给予了高度重视，做了大量的工作。比如，德国的一家肉类加工厂，把微生物悬浮液当作吸收剂，制成一个两级工作的填料塔生物吸收装置，来净化含有氨、胺、硫、醇、脂肪酸、乙醇和酮等臭味物质的废气。收到了不错的效果。,微生
17、物与环保,利用微生物消除环境污染还可以与工农业废弃物的综合利用结合起来，即“变废为宝”。这的确是一个容易被人接受并可获得一定的经济效益的环境治理途径。比如说，我们的城市垃圾中含有许多有机废物，运到农村，经堆肥处理后，可以成为优良的土壤改良剂和优质肥料，因此，高效、快速的堆肥技术，一直是国内外竞相研究的重点之一。此外，前面提到的从纤维性的废弃物中生产酒精、沼气作为替代燃料，从木材、纸浆厂排放的亚硫酸盐废液中提取有用的木糖，利用糖厂废料生产单细胞蛋白等都是变废为宝的典型事例。,微生物与环保,防患于未然也同样需要借助于微生物的帮助。比如，以生物农药代替化学农药，以生物肥料代替化学肥料，不仅是农学家和
18、生物学家关注的话题，也同样是环境保护学家所关注的话题。,微生物与环保,总之，微生物在治理环境污染方面，将发挥它的神奇的、不可替代的作用。庞大的微生物家族无疑将成为我们人类对付环境污染的活的武器库。,由于石油中含有的有毒硫杂环、氮杂环所造成的酸雨对森林的破坏和城市光化学污染,由于石油泄漏所造成大批鱼类死亡的可怕景象,由于石油污染所造成海鸟死亡的可怕景象,微生物处理石油污染的效果,石油废水中常见的有毒烃类有机化合物,石油废水中常见的有毒含硫有机化合物,石油废水中常见的有毒的含氮有机化合物,必要性：生物法处理石油废水比化学法更具有竞争力。由于大部分噻吩类、咔唑类杂环化合物的化学键相当牢固，因此在常规
19、的温度和压力下，化学法几乎不可能降解石油污染废水中的有机硫、有机氮及其它难以降解的杂环化合物。,在已经筛选到的几株特殊微生物基础上，研究：,(1)以噻吩类杂环(Thiophene）作为模式反应物，研究嗜热、耐有机溶剂细菌的脱有机的代谢反应机制及其硫杂环降解的关键基因。,一、研究内容,(2)以CA(Carbozole，简称CA)作为模式降解物，研究一株具有耐有机溶剂且能降解攻击咔唑能力的细菌氮杂环代谢反应机制及其某些关键基因。,(3)以十二烷烃或石蜡为模式化合物，研究一株具有油水分离功能的特殊细菌油水分离机制，为进一步的应用打下理论基础。,含原油废水的处理效果,石蜡水的处理效果,(4)研究高温嗜
20、热细菌生长生存(大于75,好氧)的生理学和降解杂环和直链烷烃化合物的反应机制，并分离这些极端微生物的某些特殊功能基因,高效杂环物降解的基因工程菌,硫杂环降解微生物,氮杂环降解微生物,具有油水分离功能的微生物,嗜热、抗有机溶剂特殊微生物,(5)糅合上述极端微生物的几个特殊功能基因，构建高效杂环物降解的工程菌,杂环降解微生物高密度发酵,目的基因表达的最佳诱导方案,(1)减少昂贵的诱导物使用量(2)增加目的基因的表达(3)方案：I.无机硫源(氮源)有机诱导物II.廉价无机硫源(氮源)高密度培养，再诱导,(6)极端微生物和工程菌发酵工艺优化研究,齐鲁石化济南炼油厂胜利油田孤岛采油厂,硫杂环降解微生物,
21、氮杂环降解微生物,具有油水分离功能的微生物,嗜热、抗有机溶剂特殊微生物,(7)提供上述菌株进行小试和现场石油废水处理中试研究,小试,中试,(1)生长细胞代谢途径的研究：分别以DBT、CA、长链烷烃和其代谢中间衍生物反应物，检测胞内外代谢中间物和末端产物，各种反应物的利用及其代谢产物的产生来判断不同生长条件下的代谢途径和流向。(2)休止细胞杂环降解途径的研究：在非生长体系中，用具有各种活力的休止细胞作为降解杂环的催化剂，分别用DBT、THA、CA、长链烷烃及其代谢中间衍生物作为反应底物，确定生物降解酶催化体系的反应途径。(3)脱硫基因、脱氮基因及其它特殊降解基因研究：基因的分离，确认，以及该基因
22、在大肠杆菌中的高效表达，该基因产物的特性分析，基因的序列分析，重组体的构建。,二、研究关键(对上述特殊微生物，由浅入深，三个层次展开)：,(1)微生物油水分离机制的研究：由于该研究完全属新发现，很难找到有价值的参考报道。拟从微生物产生表面活性剂或长链烷烃聚集固化现象来探讨。(2)超高温微生物的优化培养：由于我们所获得的超高温嗜热耐热微生物来源于油田微生物，探讨这些微生物超高温生长的生理和发酵工艺的优化技术是较为关键的研究。,三、拟解决的技术难点,四、预期达到的研究目标(1)本项研究的成功可以填补多项特殊菌杂环降解途径研究上的空白。(2)可阐明上述极端微生物杂环降解途径和反应机制：生长体系杂环化
23、合物的降解机制；休止细胞杂环化合物的降解机制；DBT、THA、CA和长链烷烃分解途径的酶反应机制及其某些关键基因。,(3)该项目的相关的研究内容及研究方法分别可在国内外重要杂志每年有4篇以上高质量的论文发表。申报23项国内外发明专利。(4)分离、克隆34个具有独立知识产权的具有特殊降解杂环功能基因；提供34株有明显降解处理石油废水能力的菌株。,六、预期可获得的发明专利等知识产权 根据我们所掌握的信息资料，至少在下列内容可申报独立的发明专利权(见查新证明书)：(1)耐热微生物处理含氮、含硫废水；(2)超高温微生物处理石油废水;(3)石油废水油水分离的微生物技术；如果经费充足，我们拟申报12项国际
24、专利。,选取3-4株耐有机溶剂、耐高温菌株进行模式化合物研究，降解率达到80%,每年4篇以上高水平的论文,分离、克隆3-4个功能基因片断,申报2-3项专利,生长体系、催化剂降解机制研究,在采油厂进行石油废水处理，日处理量达到100-200立方，对杂环及有机烃类降解率达到90%,DNA改组进行改造，提高降解活力、底物作用范围,填补特殊菌杂环及有机烃降解的某些研究空白,主要研究内容及预期达到的目标总图,八、研究方法与实施方案,1 研究方法(1)定性确定极端微生物可能的杂环降解途径 利用GC/MS定性测定杂环降解途径中的各反应物，代谢中间物和最终产物。(2)定量确定极端微生物杂环降解活力 利用GC定
25、量测定各种反应物和产物，同时寻找比色方法，如与Gibbs显色法测定代谢反应终端产物(HBP和DHBP)的方法进行比较。,(3)杂环降解基因克隆方案(a)质粒分离：使用热突变或化学突变，验证菌株降解有机污染物的性状是否丢失。如果性状丢失，那它就是由质粒控制的，则提取质粒，通过酶切转化，筛选阳性克隆，获得该DNA片段。反之，则采取下述方案。(b)染色体上目的基因的定位克隆：目的基因在染色体上，采用AFLP分子标记进行基因定位。,发酵设备及检测控制系统 B|Braun公司,(4)杂环降解生物催化剂大量制备：用申请者所在课题组从德国贝朗公司引进的计算机全自动控制的2 L发酵罐进行发酵，提供该项研究所需
26、要的大量的具有高降解活力的菌体。,酶的性质及结构分析,以噻吩为模式物进行有机硫杂环降解研究,以咔唑为模式物进行有机氮杂环降解研究,以石蜡为模式物进行有机烃降解和油水分离机理研究,基因分离、克隆,酶的分离及纯化,质粒的分离,以AFLP为分子标记，克隆染色体上功能片断,分子改造，并在异源宿主内进行高效表达,应用GC-MS研究菌株的代谢途径,进行小规、中试模的废水处理试验,采取的研究方法（技术路线、实施方案）总图,微生物技术,环境工程,化学与化学工程,山东大学环境生物技术研究小组,脱有机硫微生物,脱有机氮微生物,具有油水分离功能的微生物,嗜热、抗有机溶剂特殊微生物,耐热细菌生物脱有机硫模式反应体系的
27、研究,提纲,生物脱硫的意义和背景微生物脱硫的途径我们的研究进展生物脱硫的实际应用,1.生物脱硫背景,环境问题已成为影响人类生存的重大问题，化石燃料煤和石油中所含有的硫是环境的主要污染源之一。微生物脱硫操作简单，成本低。脱有机硫是一个世界性难题，已受到广泛关注。,化石燃料煤和石油中所含有的有机硫和无机硫是环境的重要污染源,严重性 1998年我国有一半以上城市降水pH低于5.6。华中地区酸雨出现频率大于70%，降水的年均pH低于5.0，酸雨面积占国土面积的30%，是继欧洲、北美后世界第三大中酸雨区。迫切性 随着能源危机的逐步加剧，开采高硫化石燃料成为必然。高硫化石燃料必须预先经过脱硫处理才能进一步
28、使用。,煤炭的化学结构模型,石油大分子的放大结构图,有机硫类型,有机硫化物包括硫醇、硫化物及含硫的杂环化合物如噻吩等，共分为13类,包括176种不同结构，其中噻吩含量最多。,炼油过程中物理和化学的除硫成本大,原油中大多数的H2S是在油井现场的油气分离过程中除去的。在炼油厂采用催化裂解和加氢脱硫(HDS)过程，加热到350C后蒸馏除去结合硫，但这些技术需高温、高压，且能耗大。目前相当多的资金用于石油的物理化学法脱硫上，1993年全世界用于HDS过程的资金达250亿美元。到下个世纪，随着需求的增加和低硫原油的耗尽，高硫原油将不断增加，因此石油脱硫成为必然。,生物脱有机硫的优势,BDS在常温常压下操
29、作，而且能耗比HDS低70%-80。该过程还可回收有机磺酸盐等高值化学品，可为炼油厂增加经济效益。采用BDS技术的投资额约为加氢脱硫技术(HDS)的一半，操作费用比HDS低10%-25%。据报道，采用BDS可使FCC汽油的硫含量从1400ppm降至150ppm(以满足整个汽油组分平均硫质量含量为50ppm的要求)。从整个汽油组分来讲，炼油厂每m3成品汽油的BDSUS$，低于HDS成本。,2.微生物脱硫的途径,以二苯并噻吩为模式化合物的脱硫途径以苯并噻吩为模式化合物的脱硫途径以噻吩为模式化合物的脱硫途径,二苯噻吩(Dibenzothiophene,简称DBT)被作为一个脱有机硫模式化合物来研究,
30、在高馏分油中，超过60%的硫是以二苯噻吩(Dibenzothiophene，简称DBT）及其衍生物的形式存在的，因此实验室一般使用DBT作为生物脱硫研究的模式化合物。,生物脱有机硫代谢途径类型,(1)碳架破坏途径(C-C键被切断)(2)碳架保留途径(专一地切断C-S键而保留完整的碳架),(1)碳架破坏途径(C-C键被切断),(1)碳架保留途径(专一地切断C-S而保留完整的碳架),苯并噻吩（Benzothiophene，BTH）脱硫代谢途径,FCC汽油中主要的含硫有机化合物包括BTH及其衍生物，其中BTH占30%。Finnerty et al.（1983）报道了几株可以利用BTH为专一硫源和碳源
31、进行生长的菌株，不过由于其损失燃料热值而没有应用价值。近几年发现能够了专一性降解BTH菌株，主要包括戈登氏菌株，类芽孢杆菌，中华根瘤菌以及红球菌。,FCC汽油中硫化合物的分布及炼制油品要求,微生物脱有机硫BTH降解途径,A是BTHB是BTH sulfoxideC，D是BTH sulfoneF是benzoe1,2oxathiin S-xoideE是o-hydroxystyreneG是2-(2-hydroxyphenyl)ethan-1-al微生物包括：戈登氏菌株（Gordonia sp.）213E类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）A11-2红球菌（Rhodococcus sp.）T
32、09 中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）KT55红球菌KT462,噻吩（Thiophene）代谢,噻吩代表了最简单的杂环含硫化合物。生物处理方法，一般都会导致噻吩的降解，而得到开环的化合物。至今还没有报道通过硫专一途径脱除噻吩中硫的菌株。,其它含硫化合物的代谢,硫醇和烷烃化的硫醇。菌株为排硫硫杆菌（Thiobacillus thioparus），可以通过甲基硫醇氧化酶作用，氧化硫醇定量生成甲醛，S0和过氧化氢。,我们的研究进展,筛选获得一株可以脱硫的耐热菌株分析了菌株脱硫的途径克隆了菌株脱硫的基因进行了燃料油脱硫实验室小试,微生物脱有机硫研究的关键,在众多的文献报道和最新的情报资
33、料中我们注意到以下几点：(1)有价值的菌株的获取。我们不能用世界上已被专利保护的菌株用于将来实际的生物脱有机硫工艺中。(2)由于生物脱有机硫技术主要将被用在石油行业上，我们认为所用的菌株最好是耐热性微生物。,嗜热耐热性微生物的优势,I.石油炼制过程中的精馏后，即使在HDS后的油品温度也较高。如用耐热性的微生物可省去冷却过程所带来的麻烦，并可提高生物脱有机硫的反应速率；II.耐热微生物所含有的耐温酶类具有重要的生产潜力和应用前景。脱有机硫的耐热微生物酶催化剂热稳定好，反应速度快，较一般常温微生物优势明显；III.已发现的具降解DBT能力的微生物(如红平红球菌、诺卡氏菌)耐热能力较差，仅能在30o
34、C附近生长和脱硫;一些耐热能力较强的假单胞菌、嗜酸热硫化叶菌等微生物能在50oC左右降解DBT，但均仅能攻击C-C键，而不能有效脱除DBT中的有机硫；IV.有必要寻找能耐热、能有效攻击C-S键的微生物，如能从自然界筛选到耐热性具碳架保留途径的脱有机硫菌株最佳，并可填补这一领域的研究空白，具有重要的理论价值和应用前景。,菌株特性研究,根据16S rDNA序列分析，在NCBI上检索相近的序列，然后建立系统进化树，菌株X7B和Mycobacterium goodii有最近的亲缘关系。,Phylogenetic trees based upon 16S rDNA sequences of X7B,X7
35、B,菌株脱硫途径分析,菌株X7B可以脱除DBT中的硫，生成2-hydroxybiphenyl，该物质进一步被O-Methyltransferase作用，在羟基上甲基化，生成了2-methoxybiphenyl，总结其代谢途径如图。,菌株X7B代谢DBT的途径,OMT,针对Benzothiophene，作为模式化合物，进行了降解分析，表明菌株可以利用BTH为唯一硫源生长并脱除其中的硫生成了O-羟基苯乙烯(图)。,菌株X7B代谢BTH的GC/MS分析,菌株X7B代谢BTH的GC/MS分析,菌株X7B代谢BTH的GC/MS分析,菌株X7B代谢BTH的途径,o-hydroxystyrene,菌株脱硫研
36、究进展,以Thiophene carboxylic acid为模式化合物，进行了菌株代谢THC的途径分析。,菌株代谢THC分析,推测的THC代谢途径,菌株脱硫基因克隆,根据已经发表的红平红球菌IGTS8的脱硫基因序列，设计引物，进行PCR扩增获得了脱硫基因。将脱硫基因连接到T载体上，在大肠杆菌宿主进行表达，结果表明菌株可以利用DBT为唯一硫源进行生长，并能够脱除其中的硫生成2-HBP。同时表明不和X7B菌株一样，没有生成2-MBP。证明甲基化的性状是和另外的酶相关。,菌株脱硫基因克隆,根据脱硫基因测序结果，在NCBI检索DszC酶的同原性序列并进行了分析，结果如图。Arensforf等（200
37、2，68(2):691-698,Appl.Environ.Microbiol.）报道，通过定向进化技术，筛选获得一株菌株，可以作用于5MBT，基因测序结果表明，因为一个碱基由G变成T，导致 DszC的261位氨基酸突变（V261F）。,DszC酶的系统进化树,下一步，计划分别克隆表达DszA，B，C酶。准备使用pET表达型载体，并使用镍柱进行亲和纯化。,高密度培养脱硫催化剂进行燃油生物脱硫试验,高密度培养脱硫催化剂进行柴油脱硫试验进行汽油脱硫试验,(I)高密度生长和酶诱导二步式工艺：即解除培养中的硫源限制，先用廉价的无机硫酸盐代替有机硫，采用pH、碳源等最优控制技术，使菌体生长产量达到最大(高
38、密度菌体生长)，再用少量的有机硫诱导菌体以制备酶源。(II)高密度生长和酶诱导一步式工艺：用少量的有机硫作为酶系产生的诱导物，用无机硫作为非限制性硫源高密度生产菌体和过量生产该脱硫催化剂。,Biostat B2,pO2(%),time(h),Biostat UD50,MFCS Control,bfxhgf,xc,hg,f,生物脱有机硫催化剂优化生产,高浓度脱硫细胞培养优化,不同碳源对菌株生长的影响,高浓度脱硫细胞培养优化,不同的浓度甘油对生长的影响,高浓度脱硫细胞培养优化,不同的氮源浓度对生长的影响,高浓度脱硫细胞培养优化,pH值恒定流加碳源菌体生长及在线检测参数曲线,处理柴油（535 ppm
39、）含硫化合物检测,X7B休止细胞作用于柴油后，GC-AED检测含硫化合物变化。,535 ppm,72 ppm,柴油（535 ppm）中烷烃变化情况,GC-FID检测柴油经过生物催化剂处理前后烷烃变化，图中显示烷烃为C12-C25。,BDS汽油脱硫优点,投资成本比HDS低50，操作成本低15-25使用BDS不会降解汽油中的辛烷BDS不需要高温高压，可以减少能源消耗不产生H2S等副产品HDS促使汽油中的一些烯烃饱和，从而降低汽油的辛烷值,汽油脱硫前后含硫有机化合物的变化,汽油脱硫前后烃类物质变化情况,脱前,脱后,4.实际应用情况,BDS可广泛用于处理汽油、馏分油、催化裂解原料油、渣油。采用EBC新
40、技术，还可以生产高价值化学品，增加脱硫的经济效益。休斯顿能源生物公司（EBC）自从1992年买断了IGT的脱硫技术以来，约投资了5,500万美元用于研究，使生物脱硫技术有了长足的发展。,BDS脱硫流程图,转化BDS过程中间物获得有价值的中间物,4.实际应用情况,目前EBC正在进行着原油和汽油的BDS技术研究。汽油BDS工艺预计在4-6年后实现工业化，目标是将汽油产品的硫含量降低到50 pm以下。EBC已向Petro Star公司转让了BDS技术，将在阿拉斯加州Valdez炼油厂建成250 kt/d的BDS装置。这将是第一套工业化规模的柴油BDS装置，处理量为795 m3/d柴油，同时可产生新型芳香磺酸盐产品。,谢谢,
