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1、实验七：细胞骨架观察,一.考马斯亮蓝R250染色法观察微丝 二.甲基罗丹明标记的鬼笔环肽染色法观察微丝,一.考马斯亮蓝R250染色法观察微丝,掌握观察动物细胞内微丝的方法:考马斯亮蓝R250染色法,实验目的,真核细胞胞质中有错综复杂的纤维网,称为细胞骨架。根据纤维的直径分为微丝,微管和中间纤维。此外,还散布着一些比微丝还细的纤维。本实验观察的是由微丝平行排列组成的纤维束,在动物细胞里称作”应力纤维”.应力纤维在体外培养的贴壁细胞中尤其发达。一般当细胞充分铺展时,经考马斯亮蓝R250染色,可看到沿细胞长轴伸展的粗大纤维束,此即应力纤维。,实验原理,仪器、材料和试剂,（一）仪器光学显微镜,温箱,细
2、胞培养设备（二）材料平皿,直径30mm小染缸,载玻片,盖玻片,体外培养的贴壁细胞B-cap细胞。（三）试剂细胞培养基,磷酸缓冲液(PBS,PH7.4);0.2mol/L磷酸盐缓冲液(PH 7.3);M-缓冲液;1Triton-100(用M-缓冲液配);0.2考马斯亮蓝R250;3.0戊二醛(用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制)。,实验步骤,1.细胞培养在平皿中的盖玻片上,尚未致密时即可使用。取出盖玻片,用PBS洗涤3次。2.用1Triton-100处理25-30min,室温或37均可。3.立即用M-缓冲液轻轻洗细胞3次。4.略晾干后,用3.0戊二醛固定细胞5-15min。,5.PBS洗数次,滤
3、纸吸干。6.用0.2考马斯亮蓝R250染片子1h。然后小心用水冲洗,蒸馏水冲洗,空气中略干燥。7.普通光学显微镜下用40物镜或油镜观察。应力纤维成深蓝色。,实验步骤,注意事项,1.洗片时要轻柔，以免把细胞从载片上洗去。2.细胞盖片注意正反面。3.染色后应冲洗盖片背面，避免损伤细胞。,实验报告,1.画出你所观察到的微丝图像。2.对实验成功失败的原因进行讨论。,思考题,微丝观察实验中,1Triton-100处理细胞的作用是什么?此实验是否能看到微管,中间纤维?为什么?M-缓冲液的作用是什么?,二.甲基罗丹明标记的鬼笔环肽染色法观察微丝,掌握观察动物细胞内微丝的方法:甲基罗丹明标记的鬼笔环肽染色法。
4、,实验目的,鬼笔环肽是双环杆肽,与微丝有强烈的亲和作用，能使F-actin稳定。用荧光燃料甲基罗丹明标记的鬼笔环肽可以清晰地显示细胞中的微丝。,实验原理,（一）仪器荧光显微镜（二）材料平皿,直径30mm小染缸,载玻片,盖玻片,铝盒,体外培养的贴壁细胞如B-cap细胞。（三）试剂细胞培养基,3.7甲醛-PEMD,磷酸缓冲液(PBS,PH7.4),丙酮,甲基罗丹明-鬼笔环肽染液,甘油-PBS(9:1)。,仪器、材料和试剂,1.细胞培养在平皿中的盖玻片上,当细胞生长密度达70-80时取出放进小染缸中,PBS洗涤。甲醛-PEMD室温固定10min,用PBS洗去固定液后,略干燥再放入预冷的-20丙酮中再固定3-5min,取出略干燥。3.用甲基罗丹明-鬼笔环肽染色:滴加20 L染液在清洁的载玻片上,将盖玻片上的细胞样品反扣其上,放入湿盒内,置暗处室温下染色20-25min,然后用PBS洗涤3次,无离子水洗涤,略干燥后用甘油-PBS封片。荧光镜检,绿光激发。观察结果是微丝呈明亮的橘红色。,实验步骤,
